热休克蛋白在耳毒性损伤过程中对内耳细胞的保护作用

杨阳 查定军

空军军医大学西京医院耳鼻咽喉头颈外科（西安710032）

药物耳毒性已成为临床上普遍关注的问题，氨基糖苷类药物[1,2]如庆大霉素等和顺铂、卡铂是常见的耳毒性药物。耳毒性是指药物对听觉或前庭功能引起的损伤作用，导致听力的丧失和平衡的紊乱。人类听觉和平衡障碍通常归因于内耳中感觉毛细胞的死亡，由特定凋亡蛋白的活化介导。响应细胞应激的热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)的诱导是生物体普遍存在且高度保守的反应，该过程能够通过抑制凋亡蛋白显著抑制某些系统中的细胞凋亡，因此其在耳毒性损伤中的保护作用得到了广泛关注。本文就热休克蛋白家族中几个关键性热休克蛋白在内耳耳毒性损伤过程中的机制等相关研究进行简要综述。

1 热休克蛋白简介

1.1 热休克蛋白的发现

热休克蛋白是一类存在于生物体内高度保守、受到高温、低温、缺血、氧化等刺激后迅速诱导产生的蛋白质，能够阻止蛋白质发生错误折叠、稳定胞内蛋白构象并介导蛋白质到达目标细胞器。HSPs的发现是从黑腹果蝇唾液腺多丝染色体上的“膨突”现象开始的，研究表明这种现象是由于外界温度升高导致该区带基因转录增强产生一种新的蛋白质所致，这种蛋白质被命名为热休克蛋白[3]。编码热休克蛋白的基因在细菌、酵母、果蝇中有大于50%的相似度。

1.2 热休克蛋白的分类与分布

HSPs的分类有很多种，目前，认同较多的是根据相对分子量大小及等电点将其大致分为:HSP110、90、70、60和 sHSP 五大家族。也有学者按照调控方式将其分为三大类:构成型HSPs(Constitutive or cognate heat shock proteins，HSCs)、诱导型 HSPs(Inducible heat shock proteins，HSPs)和HSPs类似物(HSPs cognate，HSCs)。构成型 HSPs是一类在正常状态下固定表达的HSPs，参与细胞组成结构、正常代谢和生理作用；诱导型HSPs是组织细胞受到外界刺激时表达，以提高组织细胞耐受性的一类HSPs；HSCs是当机体细胞处于正常代谢和生理调控过程中产生的蛋白质。

正常生理条件下HSPs广泛存在于肾、肝、肺等包括内耳在内的器官中，在真核生物的细胞质、细胞核、内质网以及线粒体内呈现基础表达。HSPs通常占细胞总蛋白量的5%，在高温等应激反应条件下，在巨噬细胞、神经细胞、肌肉细胞等细胞内被显著诱导，表达水平最高可能升至细胞总蛋白量的15%。

1.3 热休克蛋白的结构与功能

HSPs主要由高度保守的能够与ATP结合的氨基端和多变性的能够结合未折叠多肽的羧基端两部分构成。HSPs基因的表达通过热休克因子(heat shock factors，HSFs)和热休克元件(heat shock elements，HSEs)来实现，其转录可分为:1、HSF的激活；2、HSF与HSE的结合；3、HSPs的基因转录。正常情况下单体形式存在的HSF不具有与HSE结合的能力，只有当HSF形成三聚体时才能结合HSE，从而促进HSPs基因转录。当生命体受到不同应激原刺激时，机体组织内不断增多的受损伤蛋白会以竞争的形式与HSPs的氨基端结合，来恢复其自身的功能结构。而在这时，被游离出来的HSF继续形成三聚体进入细胞核，结合HSE并促进HSPs基因转录。当HSPs达到一定量时会和HSF结合从而抑制HSPs基因的表达。

HSPs由于磷酸化、甲基化等产生的多种异构体会影响其功能与代谢的稳定性，并影响其与不同的蛋白质形成复合体，通过形成和解离参与有关蛋白的折叠、细胞内运输和降解等，来调节靶蛋白的活性和功能，但并不参与靶蛋白的组成，因此也被称为“分子伴侣”[4]。其次，HSPs能够维持细胞内的生物活性，包括细胞内看守自卫、抗理化因素及反应性过氧化物等的损伤[5]。第三，HSPs能够参与抗原提呈加工、协同免疫及自身免疫[6]。此外，还有影响胚胎的发育、作为凋亡途径的抑制剂[7]等功能。

2 热休克蛋白在内耳耳毒性中的研究

Neely等[8]发现HSP72在正常豚鼠耳蜗中表达，随后人们对HSPs在内耳中进行了越来越深入的研究，目前已从基本的蛋白表达过渡到了DNA分子水平，而如何从基因、转录及蛋白表达层面揭示HSPs的不同生物效应已经成为HSPs的关键研究方向。

内耳耳毒性损伤与能够促进细胞凋亡和坏死的活性氧（ROS）的产生有关，HSPs感知耳毒性药物损害和启动响应的机制还未在研究中得到确切结论。研究表明各种应激诱导产生HSPs的共同信号可能是蛋白质的损伤，ROS能够诱导HSF1的活化和HSPs的产生在很多系统中也都得到了证实[9]。然而，ROS是否是直接作用于HSF1水平以改变其活性尚不清楚。

2.1 HSP70对耳毒性损伤的保护作用

HSP70是最重要的热休克蛋白之一，在正常细胞内和应激状态下都有表达，响应热休克上调表达最多，参与内质网蛋白质合成过程中的组装和转运以及变性蛋白质的降解。

有学者发现顺铂的浓度对大鼠外毛细胞中HSP70的表达强度有影响：较低剂量（5-10 mg/kg）顺铂在注射3h内HSP70水平相对快速升高，至12h表达量稳定不变；但较高剂量（20 mg/kg）顺铂在注射后表达量变化不明显，且6h后抑制HSP70表达[10]。有研究发现顺铂、卡那霉素和庆大霉素均能够诱导HSP70在豚鼠耳蜗中表达，表达部位在Corti器、血管纹、螺旋韧带、内螺旋缘、螺旋神经节[11]。随着研究的深入，暴露于新霉素和顺铂中的椭圆囊体外培养中发现，HSP70在毛细胞耳毒性药物损伤中起保护作用[12]。利用Hsp70.1和Hsp70.3基因敲除小鼠和Hsp70过表达的小鼠进行研究发现：无论是在前庭椭圆囊还是耳蜗组织中，HSP70过表达都能够抑制氨基糖苷类诱导的毛细胞死亡，并在体内减缓听力丧失[13]。同样，HSP70可以参与保护毛细胞免受顺铂毒性的观点也被Roy等证实，声预处理后的小鼠能够增加耳蜗毛细胞中HSP70的表达，并且增强毛细胞对顺铂诱导的细胞凋亡的抵抗能力[14]。小鼠椭圆囊体外培养也证实，热休克对HSP70基因敲除小鼠的椭圆囊顺铂诱导的毛细胞死亡没有显著的保护作用，同时利用组成型表达rHSP70i（rHSP70i CE）的转基因小鼠证明HSP70的组成型表达对顺铂诱导的毛细胞死亡起到部分保护作用，而热休克诱导HSP70过表达对顺铂诱导的毛细胞死亡起到更大的保护作用[15]。

HSP70在毛细胞耳毒性药物损伤过程中发挥的具体效应机制仍然尚无定论。一种可能的机制是非感觉细胞分泌HSP70，以旁分泌方式作用于毛细胞。May等[16]研究表明，在小鼠前庭椭圆囊支持细胞中利用腺病毒介导HSP70过表达可以抑制耳毒性损伤引起的毛细胞死亡。此外，将没有经过热休克的椭圆囊与热休克后的椭圆囊体外共培养发现，没有经过热休克的椭圆囊也能够抑制毛细胞的死亡，然而与HSP70基因敲除小鼠热休克后的椭圆囊共培养的没有热休克的椭圆囊没有了对毛细胞耳毒性损伤的保护作用，表明支持细胞介导HSP70保护毛细胞免受耳毒性的损伤。HSP70可能通过阻止受损蛋白质的积累和聚集，以及通过促进变性蛋白质的适当再折叠来保护细胞免受损伤诱导的死亡，这在其他系统中也已经得到证实[17]。HSP70在内耳中的保护机制的受体和下游介质目前都没有得到研究的证实，HSP70的作用模式是否是通过非感觉细胞直接或间接的影响毛细胞是值得我们深入挖掘的问题。

2.2 HSP32对耳毒性损伤的保护作用

HSP32，也称为血红素加氧酶1（HO-1），是血红素加氧酶蛋白家族的应激诱导成员，在底物的诱导及各种氧化应激条件下会增加表达量，广泛存在于心、脑、肺、肾等组织和红细胞中，是血红素分解代谢过程中的限速酶，分解血红素、产生胆绿素、游离铁和一氧化碳，在应激相关条件下调节各种细胞功能，包括细胞因子产生、细胞增殖和细胞凋亡。

Watanabe等[18]的研究表明HSP32定位于耳蜗，并在热休克后诱导表达。Fairfield等[19]证明HSP32在正常成年大鼠耳蜗的外毛细胞中组成型表达，但表达量低，热激后，其表达量被显著诱导，定位在Corti器内的部分外毛细胞以及血管纹的边缘和中间细胞中。Kim等[20]证明HSP32能够保护由顺铂诱导的HEI-OC1细胞凋亡，并且抑制剂ZnPPIX对HSP32活性的抑制和HSP32 siRNA的转染显著的消除了HSP32在顺铂处理的细胞中的保护作用，可能的机制是HSP32分解代谢产物CO和胆红素。胆红素是一种能够清除过氧自由基并抑制脂质过氧化的抗氧化剂[21]，它能够下调ROS从而抑制HEIOC1细胞的凋亡。体外培养前庭椭圆囊的研究显示，HSP32在椭圆囊巨噬细胞中表达，并对顺铂诱导的椭圆囊毛细胞死亡有显著的保护作用，同时过表达HSP70和HSP32，对顺铂诱导的毛细胞死亡并没有累加或协同作用[15]。这项研究同样表明非感觉细胞是毛细胞存活和死亡的关键调节因素[22]。除了对耳蜗毛细胞的保护之外，HSP32还可能参与顺铂损伤螺旋神经元后的修复过程[23]。

然而，HSP32的效应机制尚不清楚，猜测其保护作用可能依赖于巨噬细胞的分泌体系。肝缺血-再灌注损伤（IRI）系统中已经证明HO-1是常驻巨噬细胞分化所必需的，在体内具有保护作用[24]。其他研究表明，凋亡细胞衍生的S1P诱导原代巨噬细胞中有HO-1的表达，HO-1参与M2型巨噬细胞的极化，增加抗细胞凋亡蛋白如Bcl-2或Bcl-XL和Adora A2A的表达[25]。转染HO-1基因的巨噬细胞可明显降低促炎因子TNF-α、IL-6表达并升高抗炎因子IL-10的表达,显著减轻大鼠急性心肌梗死(AMI)区炎症和氧化损伤[26]。

前人的研究表明通过药理学调节特异性激活HSP32基因表达或可成为干预治疗耳毒性的新靶标。然而，HSP32在体内对毛细胞的保护机制究竟是通过分解代谢产物CO和胆红素来作用，还是依赖于巨噬细胞的分泌体系或是其它途径，依靠现有的研究还无法解释清楚。

2.3 其他热休克蛋白对耳毒性损伤的保护作用

HSP27、HSP60等热休克蛋白在正常大鼠内耳中均有表达，且在不同部位组织表达不均一。田克勇等[27]研究发现HSP60在正常大鼠耳蜗Corti器上的支持细胞中呈构成型表达，硫酸卡那霉素损伤后表达量降低，推测其可能参与了药物性耳聋的发病过程。梅玲等[28]研究发现HSP27主要表达于耳蜗基底膜Corti器中外毛细胞的表皮板、外毛细胞的侧壁、内外柱细胞表面和外柱细胞的头、体以及足板，在内毛细胞和支持细胞上没有表达。在发育成熟的正常Wistar大鼠耳蜗中，HSP27主要的作用是稳定肌动蛋白微丝结构的正常、维持细胞骨架的稳定、维持耳蜗内活性氧水平的正常以及执行分子伴侣的功能，从而维持耳蜗正常的生理功能。据报道，一种在日本临床开发和使用的非环状聚异戊二烯GGA能够通过增加HSP27、HSP40和HSP70的表达抑制氧化应激产物的升高来减弱顺铂诱导的耳毒性并能够抑制耳蜗中促炎细胞因子的表达，对噪声创伤具有保护作用[29]。可能的机制是GGA激活HSF1，该转录因子促进HSPs mRNA的合成，但HSP27、HSP40保护毛细胞耳毒性损伤的机制尚不完全清楚。

3 小结与展望

本文围绕热休克蛋白HSP70、HSP32、HSP27等在耳毒性损伤中的保护作用和机制做了总结与假设。不可否认，热休克蛋白在细胞耳毒性损伤过程中的保护效果有限，其保护机制决定其对于较低剂量的耳毒性药物造成的细胞损伤早期具有更好的保护作用。但随着研究方法和技术的不断改善，我们对热休克蛋白保护机制将会在探索中得到更加全面的了解，同时为有针对性的开发抗耳毒性药物损伤的保护剂提供理论基础。