Ca2+和Mg2+对红薯叶总黄酮提取及抑菌活性的影响

张亦琳，延 永，田小龙

商洛学院生物医药与食品工程学院，商洛 726000

中医是人类智慧的结晶，为中华民族的繁荣发展做出了卓越的贡献，但中药发展面临的诸多问题阻碍了中医现代化进程[1]。比如，水质对中药汤剂的药效会产生显著影响。李时珍在《本草纲目》中记载不同的水(雨水、泉水、井水等)因水质硬度不同(Ca2+和Mg2+含量不同)对疗效有巨大影响。莫国轩[2]指出金属离子对药物疗效有重要影响，药物的有效成分与离子发生作用，可提高疗效或者增加毒性，使药物原有的药物疗效发生改变，比如强心苷类药物会与机体中的钾离子作用，导致中毒症状，而Mg2+则可降低其毒性[3]；药物分子与Fe3+结合使其含量降低会导致疲劳、免疫力下降等症状[4]。鉴于金属离子对药物有效成份的重要作用，对于植物有效成份的提取应充分考虑水质(离子含量)对提取物活性的影响，令人遗憾的是，目前该领域的研究尚待开拓。

红薯叶为旋花科植物红薯Ipomoeabatatas(L.)Lam成熟后地上秧茎顶端的嫩叶，素有“蔬菜皇后”、“抗癌蔬菜”、“长寿蔬菜”等美誉[5]。红薯叶作为红、薯生产的副产品，它富含生物活性成份，具有极高的保健作用和药用价值[6]，研究表明红薯叶黄酮可提高机体免疫能力[7]，促进新陈代谢[8]，还可以降低血清含糖量[9]，畅通大小便、预防各类动脉硬化和细胞发生癌变[10]、缓解眼疲劳和补充维生素A等[11]，其提取物还可被开发为面膜[12]等护肤产品，红薯叶总黄酮的提取和生物活性研究一直是关注的热点[13]。

本研究考察了自然界水中含量最多的Ca2+和Mg2+对红薯叶总黄酮提取和抑菌活性的影响。通过单因素和响应面优化方法获得红薯叶的提取过程中引入Ca2+和Mg2+的最佳工艺，得到引入Ca2+和Mg2+的红薯叶总黄酮提取物，探索Ca2+和Mg2+对红薯叶总黄酮类化合物提取和抑菌活性的影响，为研究硬水中常见Ca2+和Mg2+对植物资源开发利用的影响提供新的思路和建立理论基础。

1 材料与仪器

1.1 实验材料

红薯叶采摘于商洛学院试验田。

无水乙醇(分析纯，利安隆博华医药化学有限公司)，亚硝酸钠、硝酸铝、水合氯化镁、氢氧化钠、无水氯化钙(分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司)，芦丁标准品(中国药品生物制品研究所，纯度95%)，MH培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)，红四氮唑(天津志远科技有限公司)，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌(商洛学院微生物实验室)。

1.2 实验仪器

数显恒温水浴锅HH- 4型(邦西仪器科技上海有限公司)、紫外分光光度计UV- 225型(大连市仪器制造公司)、电子天平S- 114型(丹佛仪器北京有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱DHG- 9123A型(上海齐欣科学仪器有限公司)、高压蒸汽灭菌锅MLS- 3780型(上海鼎谦生物科技有限公司)、恒温振荡器ZD- 85型(常州智博瑞仪器制造有限公司)。

2 实验方法

2.1 芦丁标准曲线的绘制

称取芦丁标准品0.050 2 g于洁净烧杯中，以20 mL 70%乙醇微热至溶解，转移至50 mL容量瓶，加水定容后，得到质量浓度为1.0 mg/mL芦丁标准品溶液。移取该溶液10 mL于100 mL容量瓶中，加水定容后取0、1、2、3、4、5、6 mL稀释液分别置于25 mL容量瓶中，依次加5%亚硝酸钠溶液1 mL，待反应6 min后加10%硝酸铝1 mL，6 min后加入4%氢氧化钠溶液10 mL，加水至刻度，15 min后于510 nm下测定吸光度值(A)。以芦丁标品溶液质量浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=9.941 8X+0.002 6 (R2=0.996 4)。

2.2 总黄酮含量测定及提取率计算

取1 mL提取液，按2.1方法处理后于510 nm处测定吸光度(A)，通过标准曲线计算出提取液质量浓度，再通过公式(1)计算总黄酮提取率。

(1)

式中，Y为总黄酮的提取率(%)；c为浓度(mg/mL)；N为稀释倍数；V为提取液体积(mL)；W为药材粉末的质量(mg)。

2.3 单因素试验

称取干燥红薯叶粉末1.0 g，置于100 mL圆底烧瓶中，加入Ca2+浓度分别为125、150、175、200、225 mg/L，Mg2+浓度为200 mg/L的60%乙醇溶液30 mL，在60 ℃下加热搅拌2 h，测试Ca2+浓度对总黄酮提取率的影响；加入Mg2+浓度分别为125、150、175、200、225 mg/L，Ca2+浓度为200 mg/L的60%乙醇溶液30 mL，在60 ℃下加热搅拌2 h，检测Mg2+浓度对总黄酮提取率的影响；加入Ca2+和Mg2+浓度为200 mg/L的40%、50%、60%、70%、80%乙醇溶液各30 mL，在60 ℃水浴中下提取2 h，测试乙醇浓度对总黄酮提取率的影响；加入Ca2+和Mg2+浓度为200 mg/L的60%乙醇溶液30 mL，在60 ℃条件下，分别提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，测试提取时间对总黄酮提取率的影响；加入Ca2+和Mg2+浓度为200 mg/L的60%乙醇溶液，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，并在水浴温度60 ℃下，提取2 h，测试料液比对总黄酮提取率的影响。待体系冷却后过滤，将滤液转移置50 mL容量瓶，加水至刻度，取1 mL置于25 mL容量瓶中，按2.1方法处理后测定吸光度值(A)，计算总黄酮提取率。

2.4 响应面试验设计

根据单因素实验结果筛选出四个影响最显著的因素以及三组最佳水平，利用Design- Expert 8.0.6 Trial中Box- Behnken试验设计，以提取物总黄酮含量为考察指标，优化出包含有Ca2+和Mg2+的红薯叶总黄酮提取最佳工艺。因素水平设计如表1。

2.5 验证性实验及浸膏制作

对模型模拟得出的最优工艺进行三组平行实验，以验证响应面实验的准确性与吻合度。浸膏制作采用醇溶性浸出物的热浸法[14]。量取提取液25 mL置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，移至干燥器中，冷却30 min，迅速精密称定重量，计算，即得总浸膏得率。

表1 因素水平表

2.6 抑菌活性研究

待测液配置：称取所得浸膏1 154.72 mg置于50锥形瓶，去离子水(50 mL)溶解，转移至100 mL容量瓶，去离子水定容，得到总黄酮浓度为2 000 μg/mL的药液。溶液中Ca2+和Mg2+浓度分别为542.4和510.8 μg/mL。以此浓度标准配置对照品1(总黄酮浓度为2 000 μg/mL)、对照品2(总黄酮浓度为2 000 μg/mL，后加入Ca2+和Mg2+且浓度分别为542.4、510.8 μg/mL)、对照品3(Ca2+浓度为542.4 μg/mL溶液)、对照品4(Mg2+浓度510.8 μg/mL溶液)、对照品5(Ca2+和Mg2+且浓度分别为542.4和510.8 μg/mL溶液)。

MH培养基的制备[15]，菌种活化[16]、菌悬液的配制[17]参考文献方法。采用二倍稀释法[18]，在96孔板第1孔中加入160 μL含有红四氮唑的MH培养基，然后分别加入40 μL对应的6种待测液(药液、对照品1、对照品2、对照品3、对照品4、对照品5)，第2～11孔中加入红四氮唑培养基100 μL，第12孔加200 μL作为阴性对照，然后于第1孔吸取100 μL置第2孔，于第2孔中吸取100 μL于第三孔，以此类推至第11孔时，多余100 μL溶液弃去，使药液稀释成为二倍系列稀释浓度，然后依次加入三种已经稀释好的菌液100 μL，无菌条件下放置12 h，观察孔板每孔颜色变化，最后根据颜色变化及初始浓度得出最小抑菌浓度。

3 结果与讨论

3.1 单因素实验

由图1可见，随着Ca2+浓度的增加红薯叶总黄酮提取率增加，当达到175 mg/L时，提取率达到最大值2.49%，继续增加Ca2+浓度，提取率出现下降趋势。根据测试红薯叶总黄酮提取率的高低，选Ca2+浓度为150、175、200 mg/L三个水平进行响应面优化；当加入Mg2+浓度在125- 175 mg/L范围时，红薯叶总黄酮提取率与Mg2+浓度呈现正相关，当Mg2+浓度达到175 mg/L时，提取率达到最大值2.44%，随后出现下降趋势。因此，选Mg2+浓度为150、175、200 mg/L三个水平进行响应面优化；乙醇浓度的增加使红薯叶总黄酮的提取率增加明显，当增加至70%，提取率达到最大值2.55%。可能是该比例溶剂极性与黄酮极性匹配，有利于黄酮的溶出。根据测试红薯叶总黄酮提取率的高低，选乙醇浓度为60%、70%、80%三个水平进行响应面优化；在提取时间0.5～1 h的测试范围内，红薯叶总黄酮提取率与提取时间成正相关，1 h时提取率达到最大值2.50%，随后出现小幅下降，可能是长时间的加热不利于红薯叶黄酮的稳定存在，综合来看，提取时间并不是红薯叶总黄酮提取的工艺的关键，因此选用提取率最高的提取时间1 h作为提取工艺的时间；在料液比测试范围内，先上升后下降，1∶40时，提取率达到最大值2.56%，提取浓度过低过高不利于黄酮类化合物溶出，选乙醇浓度为1∶30、1∶40、1∶50三个水平进行响应面优化。

图1 单因素对红薯叶总黄酮的提取的影响Fig.1 Effects of various experimental factors on the yield of total flavonoids in sweet potato leaves

3.2 响应面试验设计结果

3.2.1 因素水平的确定

利用Design- Expert 8.0.6 Trial设计并进行实验，结果表2所示：

得出响应面回归方程为：

总黄酮提取率=2.67-0.055A+0.022B+0.016C+2.5×10- 3D-5.0×10- 3AB-1.0×10- 2AC-0.05AD+0.085BC-0.03BD-0.033CD-0.20A2-0.20B2-0.12C2-0.1D2

表2 响应面实验设计及结果

方差分析见表3，在Ca2+和Mg2+存在下，对红薯叶总黄酮提取率的回归模型进行模拟，该模型F值为4.39，P值为0.0072，差异显著。失拟项F=7.67，P=0.120 7(大于0.05)，表明模型失拟不显著，真实提取率与模拟值基本一致，且与所选因素有较强的相关性，F值大小可判断各因素对提取率影响的强弱，F值越大，影响越强[19]。由此可判断影响程度顺序为Ca2+浓度> Mg2+浓度>乙醇浓度>料液比。

3.2.2 响应面图分析

根据实验数据，软件模拟得到的3D响应面图，响应面可以直观反映出乙醇浓度、料液比、Ca2+浓度、Mg2+浓度对红薯叶总黄酮提取率的影响。如图2所示，在测试范围内，随着四个因素的增加，红薯叶总黄酮呈现出先增高后降低的趋势，表明乙醇浓度、料液比、Ca2+浓度、Mg2+浓度在测试范围内具有相互影响和作用。响应面曲面斜率越大说明对应的因素对提取影响显著，综合观察，Mg2+对红薯叶总黄酮提取影响最大，Ca2+次之。

软件预测：红薯叶总黄酮提取最佳工艺为：Ca2+浓度187 mg/L、Mg2+浓度176 mg/L、乙醇浓度71%、料液比1∶40，提取时间取1 h，预测提取率为2.60%。

表3 方差分析结果

3.2.3 验证性实验及浸膏制作

对预测最优工艺进行三组平行实验验证，提取率分别为2.75%、2.78%、2.74%，平均值为2.76%(RSD=0.75)，响应面回归方程预测值与实际值较为相符。提取过程中引入Ca2+和Mg2+有利于红薯叶总黄酮的提取，较传统工艺提取率小幅提升(考虑到红薯叶产地、采摘时间、部位差异、种类、干燥方式等因素对红薯叶中总黄酮含量的影响较大，我们仅参考文献报道的传统工艺方法[20]：60%乙醇水溶液90 ℃回流提取60 min,料液比1∶40，经验证，提取率为2.2%)，可能原因是Ca2+和Mg2+与总黄酮化合物结合，使溶液中游离的总黄酮浓度降低，有利于红薯叶中黄酮类化合物的溶出。根据(《中国药典》2015版通则2201)的热浸法，制得浸膏，总浸膏得率为15.92%；经检测，浸膏中的黄酮含量为17.32%。

3.3 抑菌活性研究

表4 最小抑菌浓度(MIC)

注：1.“-”表示无抑菌作用。

Note:1."-" means no bacteriostatic effect.

图2 各因素对红薯叶总黄酮提取率影响的3D响应面图Fig.2 3D response surface diagram of the effects of various factors on the extraction rate of total flavonoids from sweet potato leaves

结果表明，在红薯叶总黄酮的提取过程中引入Ca2+和Mg2+有助于提升其抑菌活性，提取过程中引入Ca2+和Mg2+的提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为62.5、31.25、31.25 μg/mL；未引入Ca2+和Mg2+提取液的最小抑菌浓度分别为125、125、62.5 μg/mL。而在传统红薯叶总黄酮提取物溶液中后补加入Ca2+和Mg2+则对抑菌活性影响不大，单纯的Ca2+溶液和Mg2+溶液或者Ca2+和Mg2+溶液则无抑菌活性。由此可知，提取过程中溶液中的Ca2+和Mg2+与红薯叶总黄酮化合物可能形成某种具有较强抑菌活性的配合物，而这种配合物形成可能需要一定的反应条件，可能与红薯叶总黄酮的提取过程条件相似，具体的机理还需进一步验证。

4 结论

本研究考察了硬水中含量最多的Ca2+和Mg2+在对红薯叶的提取和抑菌的影响。通过单因素试验，筛选出对红薯叶总黄酮影响最显著的因素水平，通过Box- Behnken实验设计得出红薯叶总黄酮提取最优工艺为Ca2+浓度187 mg/L、Mg2+浓度176 mg/L、乙醇浓度71%、料液比1∶40、提取时间为1 h。经验证，实际提取率为2.76%，相较传统的提取工艺相提取率有小幅度的提升。含有Ca2+和Mg2+提取工艺的研发为红薯叶的开发利用(深加工提取)提供了更多的选择，使得红薯叶总黄酮的提取成本得到降低，提取溶剂由“蒸馏水+乙醇”延伸为“自来水+乙醇”。

测试了在提取中引入Ca2+和Mg2+提取物抑菌效果。结果表明：在红薯叶总黄酮提取中引入Ca2+和Mg2+提取物抑菌活性显著提升，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为62.5、31.25、31.25 μg/mL，低于未引入Ca2+和Mg2+提取液。该结论为红薯叶开发和利用提供了更多的思路，为研究硬水中常见Ca2+和Mg2+对植物资源开发利用的影响提供新的思路和建立理论基础。