夏黑葡萄藤放置过程中化学成分的变化及可能变化机制分析

严思恩，赵康宏，何英杰，刘东波,3，王 蕾,4，谢红旗,3*

1湖南农业大学园艺园林学院；2国家中医药管理局亚健康干预技术实验室；3湖南省植物功能成分利用协同创新中心，长沙410128；4辽宁晟启昊天生物医药科技有限公司，沈阳110000

葡萄品种夏黑(Vitisvinifera×Vitislabrusca, Summer Black)属于欧美杂种，抗逆性强、果实无核、果皮紫黑、具有独特香味，已成为我国的鲜食葡萄品种之一[1]。葡萄采收之后一般会对其进行修剪、整枝[2]，以提高葡萄产量与品质，修剪掉的葡萄枝蔓则被当做废弃物进行焚烧。然而，研究发现葡萄藤中含有许多生物活性成分，如反式白藜芦醇、ε- 葡萄素等芪类化合物以及儿茶素、表儿茶素等黄酮类化合物[3,4]。其中，芪类化合物不仅对老年痴呆与神经元细胞损伤具有良好的防治作用[5,6]，而且对癌症与炎症也具有一定的疗效[7,8]。芪类化合物是一类植物抗毒素，当植物受到生物或非生物胁迫时能够大量产生[9]。课题组前期研究发现葡萄藤枝蔓在整枝阴干过程中反式白藜芦醇与ε- 葡萄素含量会发生显著变化，但机制尚不明确[10]。本文采用UPLC- Q- TOF- MS方法对夏黑葡萄藤中的主要化学成分进行初步鉴定，并通过HPLC法对夏黑葡萄藤在放置过程中化合物的含量变化进行分析，以期揭示夏黑葡萄藤在放置过程中化合物的变化规律和化合物之间的转化机制，为提高葡萄藤的综合利用及探索芪类化合物的生物来源提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄藤采收于国家中药材生产(湖南)技术中心核心基地，经唐其副教授鉴定为夏黑葡萄(Vitisvinifera×Vitislabrusca，Summer Black)。

甲醇、乙腈，(色谱纯)德国Merck试剂公司；甲酸，(分析纯)上海国药集团试剂有限公司；去离子水由超纯水仪(四川优普超纯科技有限公司)制得。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(美国Agilent 1260)；超高效液相色谱仪联用四级杆串联飞行时间质谱仪(美国Agilent 1290)；KM- 5200DV超声仪(昆山超声仪器有限公司)；XS205分析天平(METTLER TOLEDO)；GZ- 800- GSⅡ智能人工气候箱；优普超纯水机(UPR- 10T)。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将采收的新鲜葡萄藤枝蔓(35 cm左右)放入温度为 20 °C、 湿度为 45%的恒温人工气候箱，分别在第0、2、5、10、15、20、48、80 天随机取样。样品烘干后粉碎过2 号筛，备用。

1.3.2 水分测定

参照《中国药典》2015版通则下水分测定法中第二法(烘干法)测定供试品含水量。

1.3.3 供试品溶液的制备

样品制备参考Xie[11]提取葡萄藤中化合物的方法，并加以优化。具体操作如下，将样品粉碎后，准确称量5.0 g，置于250 mL磨口锥形瓶中，按料液比为1∶20加入100 mL甲醇，连瓶一起称重记为M；再在锥形瓶外包裹上一层锡箔纸，进行超声提取1 h；提取完成后取下锡箔纸，擦干锥形瓶外的水，待提取液冷却至室温时称重，并用甲醇补足重量至M，8 000 rpm离心10 min，取上清液过0.45 μm微滤膜，得HPLC检测用供试品溶液；取上清液过0.22 μm微滤膜，得UPLC- Q- TOF- MS分析用供试品溶液。

1.3.4 色谱条件

色谱柱为：Agilent- ZORBAX SB- C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5.0 μm)，流动相为0.1%甲酸水(A)～乙腈(B)，梯度洗脱，洗脱程序：0～5 min，15% B；5～8 min，15%～18% B；8～10 min，18% B；10～20 min，18%～23% B；20～25 min，23%～30% B；25～35 min，30%～40% B；40～45 min，15% B。流速0.8 mL/min，进样量10 μL，检测波长306 nm，柱温30 °C。

1.3.5 质谱条件

通过优化质谱条件，采用负离子模式电喷雾电离离子源(ESI-)，TOF质量扫描范围m/z100～3 000；载气温度300 °C，流速8 L/min；雾化压力35 psi；鞘气温度350 °C，流速11 L/min；毛细管电压3 500 V；碰撞诱导解离电压175 V，设置碰撞能量梯度为15、20、25、30 eV。

2 结果与分析

2.1 葡萄藤中主要成分的初步鉴定

采用UPLC- Q- TOF- MS对葡萄藤中主要成分进行定性分析，如图1所示，在负离子模式下总离子流图中检测出11 个化合物。对这些主要成分进行 MS/MS分析，详细离子信息如表1所示。

化合物1的精确分子量为311.039 3， MS/MS结果表明：该化合物含有[M- H]-=179.034 6与[M-H]-=135.046 5碎片离子，表明该化合物中可能含有一个咖啡酸分子，其中母离子与咖啡酸分子之间的差值为132.358 4，可能是：2- 羟基- 3- 甲基- 4- 氧代戊酸。再结合Sánchez- Gómez等[12]的报道，推测出该化合物为trans- caftaric acid，分子式为C13H12O9，化合物结构式如图2所示。

图1 负离子模式下葡萄藤中化合物总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of compounds in grapevine under negative ion mode

化合物2与4的母离子分子量相同且碎片离子相似，但保留时间上有所差异。推测这两种化合物互为同分异构体，该结果与Sánchez- Gómez等[12]报道的葡萄藤中儿茶素与表儿茶素精确分子量相同，且与Liu等[13]报道的儿茶素类化合物的质谱裂解规律相似，并且都含有[M- H]-=161.059 1、[M- H]-=137.021 7等特殊离子碎片，由此推测这两种化合物分别为儿茶素与表儿茶素，本试验使用的是反相色谱柱，因此先出峰的为极性大的化合物[14]，因此化合物2为儿茶素，化合物4为表儿茶素，分子式为C15H14O6，结构式分别如图2所示。

化合物3的精确分子量为465.091 4，在其碎片离子中含有 [M- H]-= 285.038 6，推测可能为母离子损失掉一个单糖分子，结合Na- Na Liang[15]报道的葡萄皮中的化合物推测该化合物为：quercetin- 3-O- galactoside，分子式为C21H22O12，结构式如图2所示。

表1 葡萄藤中化合物的精确分子量及二级质谱碎片信息

化合物5的精确分子量为301.008 0，结合En[16]、Eduardo[17]报道的文章推测该化合物可能为槲皮素，二级质谱裂解碎片离子与Li[18]报道的槲皮素的电喷雾离子阱质谱分析中槲皮素在负离子模式下的裂解途径与碎片相似，由此可以推测该化合物为槲皮素，分子式为C15H10O7，结构式如图2所示。

化合物6的母离子精确分子量为477.068 3，该化合物的碎片离子中含有[M- H]-=301.032 1，与Lambert等通过UPLC- QqQ- MS检测到的化合物petunidin- 3-O-β- glucopyranoside相似[19]，推测该化合物为petunidin- 3-O-β- glucopyranoside，分子式为C22H23O12，结构式图2所示。

化合物8的母离子精确分子量为227.071 8，与反式白藜芦醇的精确分子量接近，且该化合物的离子碎片185.060 9与母离子相差42.010 9，推测出该裂解过程中失去1个C2H2O分子，同时碎片离子185.060 9，与碎片离子143.048 9之间也相差42.012 0，由此可见在该裂解过程中也失去一分子C2H2O。其裂解规律与Liu[20]报道的白藜芦醇质谱裂解规律相同，因此该化合物为反式白藜芦醇，分子式为C14H12O3，结构式如图2所示。

化合物9母离子精确分子量为453.130 1，与白藜芦醇母离子227.071 8相差226.062 1，并且在其离子碎片中含有225.050 6、119.047 4与化合物8中相同分子量的碎片，由此推断此化合物为化合物8的二聚体，并且在此聚合过程中失去两个氢。该化合物的碎片离子与Hurtado- Gaitán[21]采用UPLC- QQQ检测到的ε- 葡萄素的离子碎片信息相似，同时与Yin等[22]报道的白藜芦醇二聚体异构选择机理中ε- 葡萄素的离子碎片信息相似，因此，推测该化合物为ε- 葡萄素，分子式为C28H22O6，结构式如图2所示。

化合物7的母离子精确分子量为469.134 9，与化合物9的精确分子量相比相差16.004 8，推测可能是该化合物上的一个H被羟基取代，其次在其离子碎片中含有451.116 3、375.091 3等离子碎片，与Jia Yu等报道的trans- scirpusin A的离子碎片相似[23]，由此推测该化合物为trans- scirpusin A，分子式为C28H22O7，结构式如图2所示。

化合物10与化合物11母离子分子量之间相差226.072 3，化合物11与化合物9母离子分子量之间相差226.059 2， 而化合物化合物9与化合物8的母离子分子量也相差226.054 4，这个规律正好与化合物9与化合物8之间的相同，因此推测化合物11是白藜芦醇的三聚体，而化合物10则是白藜芦醇的四聚体，在此过程中发现白藜芦醇聚合物聚合时相邻两个聚合物之间相差226，而白藜芦醇分子量为228.071 8，也就意味着每聚合一个白藜芦醇分子就会失去两个氢。化合物10的离子碎片与Sáez等[24]报道的vitisin B的离子碎片相似，由此推测化合物10为vitisin B，分子式为C56H42O12，结构式如图2(10)所示；化合物11则与Keylor等[25]报道的白藜芦醇三聚体miyabenol C合成过程中的离子碎片相似，因此推测化合物11为miyabenol C，分子式为C42H32O9，结构式如图2所示。

图2 通过UPLC- MS- Q- TOF结果推测出的化合物结构Fig.2 The structures of the compounds inferred from UPLC- MS- Q- TOF results注：1.反式咖啡酸；2.儿茶素；3.槲皮素- 3- O- 半乳糖苷；4.表儿茶素；5.槲皮素；6.矮牵牛素- 3- O- β- 吡喃葡萄糖苷7.反式三菱素A；8.反式白藜芦醇；9.ε- 葡萄素；10.葡萄素B；11.还领多酚。Note:1.Trans- caftaric;2.Catechin;3.Quercetin- 3- O- galactoside;4.Epicatechin;5.Quercetin;6.Petunidin- 3- O- β- glucopyranoside;7.Trans- scirpusin A;8.Trans- resveratrol;9.ε- Viniferin;10.Vitisin B;11.Miyabenol C.

2.2 化合物变化规律及机制

通过HPLC对放置第0、2、5、10、15、20、48、80天的样品进行含量检测，结果如图3所示，在整个放置过程中发现8个化合物的含量发生明显变化。结合图1中化合物的保留时间分析，这8个化合物分别为反式咖啡酸(trans- caftaric acid)、儿茶素(catechin)、表儿茶素(epicatechin)、槲皮素(quercetin)、反式白藜芦醇(trans- resveratrol)、ε- 葡萄素(ε- viniferin)、葡萄素B(vitisin B)、还龄多酚(miyabenol C)。对于这8个化合物，通过计算单位质量葡萄藤(干重)各化合物对应的液相色谱图中的峰面积(S)来表示其相对含量，其中横坐标表示葡萄藤放置时间(天)，纵坐标表示化合物相对含量(S/g)，绘制各化合物含量随放置时间变化趋势图，结果如图4和5所示。

3 讨论

结果发现葡萄藤中8个化合物的含量随放置时间发生了明显变化，但变化规律不尽相同，变化规律可分为两种类型，第一类为反式咖啡酸、儿茶素、表儿茶素、槲皮素4 种化合物，其中反式咖啡酸属于苯丙素类化合物，后三种属于黄酮类化合物。4 种化合物含量随放置时间的增加都呈下降趋势，结果如图4所示；第二类为反式白藜芦醇、ε- 葡萄素、葡萄素 B、还龄多酚4 种化合物，这4 种化合物均属于芪类化合物，为白藜芦醇及其低聚物，其含量变化规律为在放置前期，化合物含量显著上升，达到一定时期后含量开始下降，变化规律如图5所示。

图3 葡萄藤放置不同天数时其中化合物的变化情况Fig.3 Changes of compounds in grapevines during different days of storage

图4 葡萄藤放置过程中trans- caftaaric acid、catechin、epicatechin、quercetin含量变化趋势图Fig.4 Trends of trans- caffeic acid,catechin,epicatechin and quercetin contents in grapevine during storage

在第一种现象中，反式咖啡酸含量随放置时间的增加呈下降趋势，反式咖啡酸属于苯丙素类化合物，是葡萄植株中黄酮类化合物与芪类化合物的生物合成途径中的合成前体物质，黄酮类化合物与芪类化合物生源合成途径如图6所示[26]。葡萄藤的采收后，在一定时间内相当于对其造成机械损伤及生理干旱，都属于逆境胁迫过程，此时植物体内大量合成植物抗毒素来抵御逆境，而芪类化合物就属于植物抗毒素之一，因此葡萄藤中启动了芪类化合物的合成。反式咖啡酸作为芪类化合物的合成前体物质被大量消耗，导致反式咖啡酸含量急剧降低。在生源合成途径中，tetraketide intermediate是葡萄植株中黄酮类化合物和芪类化合物生源合成的共同底物，当调控底物的合成基因为chalcone synthase(CHS)时合成黄酮类化合物，当调控底物的合成基因为stilben synthase(STS)时合成芪类化合物[27]，并且CHS基因与STS基因之间存在竞争关系[28]。STS基因属于抗逆基因，当葡萄藤在逆境胁迫下，调控芪类化合物合成的STS基因表达量上升，因此调控黄酮类化合物合成的CHS基因表达量下降，使得黄酮类化合物无法继续合成，葡萄藤中原有的黄酮类化合物(catechin、epicatechin、quercetin)发生自然降解导致含量下降，因此catechin、epicatechin、quercetin在放置过程中含量逐渐降低，到第15天左右时基本完全降解，结果如图4所示。

图5 葡萄藤放置过程中trans- resveratrol、ε- viniferin、vitisin B、miyabenol C的含量变化趋势图Fig.5 Trends of trans- resveratrol,ε- viniferin,vitisin B and miyabenol C contents in grapevine during storage

图6 葡萄中黄酮化合物与芪类化合物合成途径Fig.6 Synthetic pathways of flavonoids and stilbenes in grapes注：PAL：苯丙氨酸解氨酶；C4H：肉桂酸- 4- 羟基化酶；4CL：香豆酸辅酶A连接酶；CHS：查尔酮合酶；STS：二苯乙烯合酶。Note:PAL:phenylalanine ammonia- lyase;C4H:cinnamate 4- hydroxylase;4CL:4- coumarate;CHS:chalcone synthase;STS:stilben synthase.

对于第二种现象，在之前的研究中发现葡萄藤在放置过程中反式白藜芦醇、ε- 葡萄素含量表现出先上升再下降的现象，并且反式白藜芦醇、ε- 葡萄素在鲜样中含量极低，但是在第二天这两种化合物含量几乎上升了十几倍，白藜芦醇作为一种植物抗毒素在植物处于逆境时会大量产生用于保护自身。在葡萄藤的采收后前20天内的放置过程相当于对其造成机械损伤及生理干旱，并且此时葡萄藤生命并未完全终止，因此体内抗逆基因表达量上升引起白藜芦醇含量上升[29]；当放置到20天左右含量达到最高，分别约为鲜样的250倍与190倍。在本次研究中发现含量变化与之相类似的还有葡萄素 B、还龄多酚两种化合物，从结构上看这两种化合物也属于芪类化合物，都是以白藜芦醇分子为基本单位的不同聚合体，分别为白藜芦醇的三聚体和四聚体。两种化合物作为白藜芦醇的聚合体，在鲜样中含量几乎为零，如图5所示，在放置第10天时葡萄素 B、还龄多酚含量开始上升，白藜芦醇作为聚合体的合成底物，白藜芦醇含量上升为聚合物合成提供充足的底物。此时反式白藜芦醇、ε- 葡萄素在第10～15天期间含量上升速率不如前10天，由此可知从第10天开始反式白藜芦醇、ε- 葡萄素正在聚合为葡萄素 B、还龄多酚。在葡萄藤放置20天后白藜芦醇与ε- 葡萄素含量开始下降，在此期间葡萄藤生命还未完全终止，但是由于采收后的葡萄藤中合成白藜芦醇的前体物质消耗殆尽，无法再继续合成白藜芦醇和葡萄素导致白藜芦醇与ε- viniferin含量开始下降；而对于葡萄素 B、还龄多酚来说，此时葡萄藤中已经累积了大量白藜芦醇与ε- 葡萄素，白藜芦醇作为葡萄素 B、还龄多酚的聚合底物，在20天后仍可继续合成聚合物，葡萄素 B、还龄多酚含量继续上升，一直到50天左右后，此时的葡萄藤已经完全干枯，生命完全终止，因此葡萄素 B、还龄多酚的生物合成也已终止，葡萄素 B、还龄多酚含量开始下降。葡萄藤干枯后，各种化合物产生自然降解，由于物质的稳定性不同，每种化合物含量下降的速率也不尽相同，白藜芦醇作为其它三种化合物的合成底物，所以后期降解速率最快直到完全消失。

夏黑葡萄藤在放置过程中，苯丙素类化合物(trans- caftaric acid)与黄酮类化合物(catechin、epicatechin、quercetin)在第二天或第五天含量略有起伏，推测应该为植物体的应激反应。对于葡萄藤放置一段时间后中其中芪类化合物含量显著上升的现象，主要是由于在葡萄藤采收后20天左右枝蔓生命并未完全终止，在此期间枝蔓受到机械损伤和干旱的环境胁迫，刺激到调控植物抗毒素即芪类化合物合成的的基因表达量上升，以至于芪类化合物含量上升。实验中发现白藜芦醇的三聚体(vitisin B)和四聚体(miyabenol C)在新鲜材料中基本不存在，是在放置过程中产生的新化合物，这为vitisin B和miyabenol C开发利用提供了新的途径。由于8个化合物的标准品不易制得，本研究没有采用标准品进行各化合物定量分析，在后续研究中将继续进行标准品的制备和绝对定量分析，同时将进行葡萄藤枝蔓放置过程中蛋白和芪类化合物关键控制基因的表达分析，进一步确定各类化合物的转化机制。

葡萄藤是葡萄酒工业及葡萄鲜食产业的废弃物，常规处理(焚烧堆肥)往往会造成资源浪费、利用率低下，葡萄藤中含有多种活性成分，活性成分种类及含量与葡萄的品种有关，白藜芦醇是葡萄植株中的一种特征化合物，具有较高的利用价值，通过将废弃的葡萄藤枝蔓放置后会引起白藜芦醇及其低聚物含量升高，达到开发利用其活性成分的目的，是一种理想的生物综合利用方式。

本研究采用UPLC- Q- TOF- MS及HPLC两种现代分析方法从化学成分含量变化规律的角度，以白藜芦醇为考察重点，结合白藜芦醇的生源合成途径，揭示了葡萄藤剪枝放置过程中芪类化合物的变化规律和变化机制，为废弃葡萄藤枝蔓综合利用提供了理论依据。