射干苷元衍生物的制备及其体外抗肿瘤活性研究

陈 帅，袁崇均，罗 森，余梦瑶，王 笳

四川省中医药科学院，成都 610041

川射干为鸢尾科植物鸢尾(IristectorumMaxim.)的干燥根茎，具有清热解毒、祛痰、利咽之功效，用于热毒痰火郁结证，如咽喉肿痛、痰浊壅盛、咳嗽气喘者[1]，其主要药效成分为异黄酮类物质[2,3]，而射干苷元就是其中的主要有效成分。射干苷元又名鸢尾黄素，5，7，4′- 三羟基- 6- 甲氧基异黄酮，现代研究表明射干苷元具有C6- C3- C6母核结构，也有α、β核不饱和吡喃酮以及C7- OH、C4′- OH等活性中心存在，具有清除自由基、抗脂质过氧化损伤和降低血糖，防止动脉粥样硬化以及防止血管内皮细胞损伤作用，亦有对心肌梗死小鼠心脏有保护作用，还有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、雌激素类作用等[4- 7]。本研究基于射干苷元的抗肿瘤作用，以射干苷元为先导化合物[8]，经过结构修饰、改造得到其衍生物射干苷元- 5′- 磺酸钠、4′，7- 二甲基射干苷元、4′，7- 二甲基射干苷元- 5′- 磺酸钠、4′，7- 二乙基射干苷元、4′，7- 二乙基射干苷元- 5′- 磺酸钠，并采用MTT法，考察其衍生物对HCT116、A549、HepG2细胞体外增值的影响[9,10]，初步探讨其药理活性，以期开发新型抗肿瘤的单体成分药物。

1 仪器与试药

1.1 药品

射干苷元，陕西绿清生物工程有限公司，含量：98.86%，批号：20160502；射干苷元- 5′- 磺酸钠、4′，7- 二甲基射干苷元、4′，7- 二甲基射干苷元- 5′- 磺酸钠、4′，7- 二乙基射干苷元、4′，7- 二乙基射干苷元- 5′- 磺酸钠，含量均≥98%，批号分别为：20160403、20160501、20160503、20160601、20160702，试验前用生理盐水配制成所需浓度的液体备用。

1.2 细胞

人结肠癌细胞株HCT116、人肺癌细胞株A549、人肝癌细胞株HepG2均购自中国科学院细胞保存库。

1.3 主要试剂

氢氧化钠、盐酸、乙醇、硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、浓硫酸、氯化钠，成都市科龙化工试剂厂生产，分析纯，批号分别为2015120401、2015010111、2015010201、2015070304、2015080912、2015120304、2015020301；高糖DMEM，美国GibcoBRL；MTT，乙二胺四乙酸，美国Sigma。

1.4 实验仪器

液质联用仪，型号为RRLC- 6410，美国Agilent；核磁共振波谱仪，型号为AVⅡ，德国Bruker；紫外分光光度仪，型号为UV- 2401PC，日本Shimadzu；红外检测仪，型号为FTIR8300，日本Shimadzu公司；微机熔点测定仪，型号为WRS- 2，上海易测仪器设备有限公司；电子天平型号为CPA225D，德国赛多利斯；超纯水系统，美国Millipore；CO2培养箱，型号为MCO- 15AC，日本三洋；细胞培养瓶和96孔细胞培养板，美国Corning；酶联免疫检测仪，美国Thermo Fisher；微量移液器，法国GILSON。

2 方法与结果

2.1 化合物的制备

2.1.1 化合物1的制备

取射干苷元500 g，加2 000 mL浓硫酸，搅拌溶解，反应2 h，倾入20 L NaCl饱和溶液中，边加边搅拌，析出沉淀，放置过夜，过滤，沉淀用水煮沸溶解，趁热过滤，放置，析晶，过滤，重结晶一次，过滤，60 ℃减压干燥，得化合物1(600 g，含量>98%，收率为89.55%)(见图1)。

2.1.2 化合物2的制备

取射干苷元200 g，加NaOH40 g，混匀，加95%乙醇600 mL于4 L圆底烧瓶中，于水浴中加热沸腾5分钟，再加400 mL硫酸二甲酯，反应半小时，取出，立即用盐酸调pH至2～5，加水搅拌放冷。过滤，得淡黄色粉末，用95%乙醇搅拌均匀，过滤，反复洗涤至滤出液近无色，60 ℃减压干燥，得化合物2(170 g，含量>98%，收率77.74%)。

2.1.3 化合物3的制备

取化合物1100 g，加NaOH20 g，混匀，加95%乙醇300 mL于2 L圆底烧瓶中，于水浴中加热沸腾5分钟，再加200 mL硫酸二甲酯，反应半小时，取出，立即用盐酸调pH至2～5，加水搅拌放冷。过滤，得淡黄色粉末，用95%乙醇搅拌均匀，过滤，反复洗涤至滤出液近无色，60 ℃减压干燥，得化合物3(84 g，含量>98%，收率78.53%)。

或者取化合物2100 g，加400 mL浓硫酸，搅拌溶解，反应2小时，倾入4 L NaCl饱和溶液中，边加边搅拌，析出沉淀，放置过夜，过滤，沉淀用水煮沸溶解，趁热过滤，放置，析晶，过滤，重结晶一次，过滤，60 ℃减压干燥，得化合物3(97 g，含量>98%，收率90.68%)。

2.1.4 化合物4的制备

取射干苷元200 g，加NaOH 40 g，混匀，加95%乙醇600 mL于4 L圆底烧瓶中，于水浴中加热沸腾5分钟，再加400 mL硫酸二乙酯，反应半小时，取出，立即用盐酸调pH至2～5，加水搅拌放冷。过滤，得淡黄色粉末，用95%乙醇搅拌均匀，过滤，反复洗涤至滤出液近无色，60 ℃减压干燥，得化合物4(182 g，含量>98%，收率76.69%)。

2.1.4 化合物5的制备

取化合物1100 g，加NaOH 20 g，混匀，加95%乙醇300 mL于2 L圆底烧瓶中，于水浴中加热沸腾5分钟，再加200 mL硫酸二乙酯，反应半小时，取出，立即用盐酸调pH至2～5，加水搅拌放冷。过滤，得淡黄色粉末，用95%乙醇搅拌均匀，过滤，反复洗涤至滤出液近无色，60 ℃减压干燥，得化合物5(88 g，含量>98%，收率77.24%)。

或者取化合物4100 g，加400 mL浓硫酸，搅拌溶解，反应2小时，倾入4 L NaCl饱和溶液中，边加边搅拌，析出沉淀，放置过夜，过滤，沉淀用水煮沸溶解，趁热过滤，放置，析晶，过滤，重结晶一次，过滤，60 ℃减压干燥，得化合物5(115 g，含量>98%，收率89.39%)。

2.2 化合物的鉴定

化合物1淡黄色针晶(H2O)，HCl- Mg反应阴性，AlCl3显色呈淡黄色；mp.166～168 ℃;UV(EtOH)λmax:264 nm；IR(KBr)νmax3 465，1 654，1 652，1 575，1 494，1 465，1 278，1 165，1 070 cm-1；ESI- MS：m/z425 [M+Na]+；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.84(1H，s，5- OH)，7.88(1H，s，H- 2)，7.74(1H，d，J= 2.0 Hz，H- 6′)，7.25(1H，dd，J= 2.0，8.5 Hz，H- 2′)，6.94(1H，d，J= 8.5 Hz，H- 3′)，6.21(1H，s，H- 8)，3.70(3H，s，6- OCH3)，1.31(3H，t，4′- CH3)，1.14(3H，t，7- CH3)；上述理化性质和光谱数据与文献[11]报道一致，确定此化合物为射干苷元- 5′- 磺酸钠。

化合物2淡黄色结晶性粉末(EtOH)，HCl- Mg反应阴性，AlCl3显色呈淡黄色；mp.164～167 ℃；UV(EtOH)λmax:268 nm；IR(KBr)νmax3 462，1 653，1 609，1 572，1 469，1 298，1 188，1 068 cm-1；ESI- MS：m/z329 [M+H]+；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.84(1H，s，5- OH)，7.76(1H，s，H- 2)，7.43(2H，d，J= 8.5 Hz，H- 2′，H- 6′)，6.93(2H，d，J= 8.5 Hz，H- 3′，H- 5′)，6.52(1H，s，H- 8)，3.92(3H，s，6- OCH3)，3.83(3H，s，7- OCH3)，3.81(3H，s，4′- OCH3)；上述理化性质和光谱数据与文献[12,13]报道一致，确定此化合物为4′，7- 二甲基射干苷元。

化合物3淡黄色针晶(H2O)，HCl- Mg反应阴性，AlCl3显色呈淡黄色；mp.166～169 ℃；UV(EtOH)λmax:264 nm；IR(KBr)νmax3 445，1 654，1 608，1 587，1 490，1 465，1 280， 1 181，1 084，1 025 cm-1；ESI- MS：m/z453 [M+Na]+；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.88(1H，s，5- OH)，7.96(1H，s，H- 2)，7.84(1H，d，J= 2.0 Hz，H- 6′)，7.46(1H，dd，J= 2.0，8.5 Hz，H- 2′)，6.98(1H，d，J= 8.5 Hz，H- 3′)，6.45(1H，s，H- 8)，3.94(3H，s，7- OCH3)，3.82(3H，s，4′- OCH3)，3.72(3H，s，6- OCH3)；上述理化性质和光谱数据与文献[13]报道一致，确定此化合物为4′，7- 二甲基射干苷元- 5′- 磺酸钠。

化合物4淡黄色结晶性粉末(EtOH)，HCl- Mg反应阴性，AlCl3显色呈淡黄色；mp.163～166 ℃；UV(EtOH)λmax:268 nm；IR(KBr)νmax3 465，1 654，1 608，1 577，1 490，1 465，1 290，1 180，1 074 cm-1;ESI- MS：m/z357 [M+H]+；1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.80(1H，s，5- OH)，7.86(1H，s，H- 2)，7.43(2H，d，J= 8.5 Hz，H- 2′，H- 6′)，6.95(2H，d，J= 8.5 Hz，H- 3′，H- 5′)，6.43(1H，s，H- 8)，4.15(2H，q，4′- OCH2- )，4.06(2H， q，7- OCH2- )，3.90(3H，s，6- OCH3)，1.51(3H，t，4′- CH3)，1.43(3H，t，7- CH3)；13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：180.8(C- 4)，158.9(C- 4′)，158.1(C- 7)，153.3(C- 9)，153.2(C- 5)，152.6(C- 2)，132.4(C- 6)，129.8(C- 2′，6′)，122.9(C- 1′)，122.5(C- 3)，114.3(C- 3′，5′)，106.3(C- 10)，90.8(C- 8)，64.6(4′- OCH2- )，63.3(7- OCH2- )，60.5(6- OCH3)，14.6(4′- CH3)，14.4(7- CH3)；上述理化性质和光谱数据与文献[14,15]报道一致，确定此化合物为4′，7- 二乙基射干苷元。

化合物5淡黄色针晶(H2O)，HCl- Mg反应阴性，AlCl3显色呈淡黄色；mp.166～168 ℃;UV(EtOH)λmax:264 nm；IR(KBr)νmax3 475，1 658，1 602，1 579，1 498，1 467，1 265，1 174，1 052 cm-1；ESI- MS：m/z481 [M+Na]+，459，437，330，318，274，245，138，可确认该化合物为C20H19SO9Na，不饱和度为11；比较化合物4和化合物5的核磁数据，两者基本一致，仅前者B环1H NMR谱上有4个芳氢质子信号，H- 2′和H- 3′互为邻位耦合，H- 5′和H- 6′互为邻位耦合；而后者B环上仅有3个芳氢质子信号，说明有一芳氢质子被磺酸钠基所取代；13C NMR谱显示化合物2为20个碳原子，和前者比较，仅少了1个δC114.3，取而代之的是δC130.4，结果与1H NMR谱相印证，由于苯酚磺化反应在室温进行(20～25 ℃)，只能得到邻位产物，故取代发生在C- 3′或C- 5′上，δH7.74、δH7.25互为间位耦合，δH7.25、δH6.95互为邻位耦合，证实δH7.74为H- 6′，δH7.25为H- 2′，δH6.95为H- 3′，确定取代发生在C- 5′上，由此确定了化合物5为4′，7- 二乙基射干苷元- 5′- 磺酸钠，确认为新化合物，结构未见文献报道。具体表征如下，1H NMR(DMSO-d6，400 MHz)δ：12.82(1H，s，5- OH)，7.83(1H，s，H- 2)，7.74(1H，d，J= 2.0 Hz，H- 6′)，7.25(1H，dd，J= 2.0，8.5 Hz，H- 2′)，6.95(1H，d，J= 8.5 Hz，H- 3′)，6.17(1H，s，H- 8)，4.08(2H，q，4′- OCH2- )，3.72(2H，q，7- OCH2- )，3.57(3H，s，6- OCH3)，1.31(3H，t，4′- CH3)，1.14(3H，t，7- CH3)；13C NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ：180.7(C- 4)，154.5(C- 7)，154.2(C- 4′)，153.4(C- 2)，152.7(C- 9)，152.4(C- 5)，133.5(C- 2′)，132.1(C- 6)，130.4(C- 5′)，125.6(C- 1′)，123.4(C- 3)，120.5(C- 6′)，115.3(C- 3′)，106.3(C- 10)，90.9(C- 8)，64.8(7- OCH2- )，64.3(4′- OCH2- )，60.7(6- OCH3)，14.8(7- CH3)，14.6(4′- CH3)。

2.3 化合物的化学结构和合成路线

图1 化合物的化学结构和合成路线Fig.1 Chemical structures and synthetic route of compounds注：a：依次加入浓硫酸和饱和氯化钠溶液进行磺酸化反应，收率89.55%；b：依次加入氢氧化钠，乙醇和硫酸二甲酯进行甲酯化反应，收率77.74%；c：依次加入氢氧化钠，乙醇和硫酸二甲酯进行甲酯化反应，收率78.53%；d：依次加入浓硫酸和饱和氯化钠溶液进行磺酸化反应，收率90.68%；e：依次加入氢氧化钠，乙醇和硫酸二乙酯进行乙酯化反应，收率76.69%；f：依次加入氢氧化钠，乙醇和硫酸二乙酯进行乙酯化反应，收率77.24%；g：依次加入浓硫酸和饱和氯化钠溶液进行磺酸化反应，收率89.39%。Note:a:H2SO4 and NaCl solution were added in turn to carry out the sulfonation reactioion,and the yield was 89.55%;b:NaOH,EtOH and DMS were added in turn to carry out the methyl reactioion,and the yield was 77.74%; c:NaOH,EtOH and DMS were added in turn to carry out the methyl reactioion,and the yield was 78.53%.d:H2SO4 and NaCl solution were added in turn to carry out the sulfonation reactioion,and the yield was 90.68%;e:NaOH,EtOH and DES were added in turn for ethyl reaction,the yield was 76.69%;f:NaOH,EtOH and DES were added in turn for ethyl reaction,the yield was 77.24%;g:H2SO4 and NaCl solution were added in turn to carry out the sulfonation reactioion,and the yield was 89.39%.

2.4 化合物对HCT116、A549、HepG2细胞株体外增殖的影响

2.4.1 细胞培养

分别取HCT116、A549、HepG2细胞株以含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养基(含青霉素100 U/mL，链霉素100 μg/mL)培养于37 ℃、5%CO2、饱和湿度细胞培养箱内。每隔2～3天，以0.05%胰蛋白酶- 0.53 mmol/L EDTA消化传代。

2.4.2 分组给药及检测

分别取对数生长期的HCT116、A549、HepG2细胞，用胰酶消化，吹散，制备细胞混悬液，显微计数，调整细胞浓度，按6×103个/孔接种到96孔板，在37 ℃培养过夜。设置药物组(化合物1～5浓度为320、160、80、40、20、10、5 μM的系列溶液)，空白对照组(只加培养基)和射干苷元阳性药对照组(浓度为320、160、80、40、20、10、5 μM的系列溶液)，在96孔板中分别加入适宜浓度的各组样品，每个浓度做3个重复，放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h，试验结束前4 h，将96孔板里的培养液吸出，加入100 μL PBS缓冲液和10 μL 5 mg/mL MTT溶液，37℃孵育4 h，加100 μL 10%SDS溶液(0.01 MHCl配制)，37 ℃孵育过夜，测定OD570，计算各样品浓度的抑制率(抑制率=(空白组OD- 试验组OD)/空白组OD×100%)，采用Curve Expert计算IC50。

表1 射干苷元及其衍生物体外抗肿瘤活性结果(n=3)

续表1(Continued Tab.1)

化合物CompoundIC50(μM)HCT116A549HepG24133.72±3.53108.25±4.3673.44±2.03524.71±1.8157.68±3.6332.42±1.96射干苷元Tectorigenin198.06±4.53202.50±3.35258.80±5.47

由表1可知，射干苷元及其衍生物对HCT116、A549、HepG2细胞株体外增殖有一定的抑制作用；各化合物组对HCT116、A549、HepG2细胞株的抑制明显强于射干苷元阳性药对照组，其中化合物3对A549的IC50为33.67 μM，化合物5对HCT116和HepG2细胞的IC50分别为24.71和32.42 μM，证明其有良好的抗肿瘤活性，从而证实了结构改造的可行性和必要性。

3 讨论

从天然植物中寻找安全、高效的抗肿瘤药物，是开发抗肿瘤药物的重要途径。药用植物是一个巨大的宝库，对发掘新的抗肿瘤药物有着得天独厚的优势，特别是四川，有着“中医之乡，中药之库”的美誉，川射干作为川产道地药材，野生资源丰富，采收炮制简单，提取加工方便，黄酮成分含量高，并具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒等诸多药理活性。本研究基川射干中主要成分射干苷元的抗肿瘤作用，以射干苷元为母体合成一系列化合物，并考察化合物对HCT116、A549、HepG2细胞株体外增殖的影响。结果证实，射干苷元及其衍生物均具有一定的抗肿瘤作用，特别是化合物3对于A549细胞株有良好的抑制活性，化合物5对于HCT116和HepG2细胞株有良好的抑制活性，可作为潜在抗肿瘤化合物继续研发，下一步将深入研究射干苷元及其衍生物的结构与活性关系，探讨其抗肿瘤机制，阐述其构效关系。