间充质干细胞与汗腺细胞融合实现汗腺再生的可行性研究

刘坤坤 赵亚平 高玮 高慧 谢淼

汗腺作为皮肤重要的附属器官，在体温调节、体液平衡及物质代谢等方面具有重要作用。由于深Ⅱ°以上烧伤创面皮肤附属器官被破坏，无论是应用自体皮片或组织工程皮肤封闭创面均无法使汗腺再生，导致大面积烧伤患者创面愈合后排汗、散热困难，体内热量难以顺利散发，严重影响患者工作及生活。如何实现大面积深度烧伤创面的汗腺重建，成为目前亟待解决一大难题。 目前部分学者用间充质干细胞体外培养诱导成汗腺样细胞取得了一定的初步成果，但是干细胞向汗腺细胞分化是一个复杂的过程，机制尚不明确，方法尚不成熟且很难大量获取汗腺样细胞。需要进一步寻找更容易在体外获得大量具有分泌汗液细胞的新方法。再生医学是现代医学发展的趋势，近年来，随着对细胞融合技术研究的深入，为解决这一难题提供了新的思路。有研究发现融合后的杂合细胞能够同时表达两个亲本特性，这在再生医学和组织工程学中具有很大的应用潜能和治疗价值[1]。因此，开展通过利用间充质干细胞/汗腺细胞的融合细胞来获取大量具有能分泌汗液功能的细胞的研究，对促进皮肤功能和结构的生理性修复具有重大的意义。本文就目前干细胞/汗腺细胞融合体实现汗腺再生的研究进展进行综述。

1 细胞融合技术

1.1 细胞融合技术的定义 细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交(cell hybridization),是指细胞通过介导和培养，在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合(合并)成一个核或多个核的杂合细胞的工程。利用现代科学技术，把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，这个新细胞(杂合细胞)得到了来自两个细胞的遗传物质(包括细胞核的染色体组合和核外基因)，具有新的遗传或生物特性。基本过程包括细胞融合形成异核体、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。

1.2 细胞融合技术的发展简史 1965年英国科学家进一步证实灭活病毒在合适条件下可以诱发动物细胞融合，从而揭开了细胞融合技术的研究和开发。随后相继研究出三类成熟的细胞融合技术：(1)生物法：灭火病毒诱导细胞融合。利用某些病毒如：仙台病毒、副流感病毒或者新城鸡瘟病毒被膜中的融合蛋白可以介导病毒同宿主细胞的融合，也可以介导细胞与细胞的融合，因此可以利用紫外线灭活此类病毒诱导细胞融合。(2)化学法：聚乙二醇(PEG)诱导细胞融合 PEG可以破坏和干扰各类细胞的膜结构，使两细胞相互接触部位的膜脂双层中磷脂分子发生疏散，进而使其结构发生重排，再加上膜脂双层的相互亲合以及彼此间表面张力的作用，引起相邻的重排质膜在修复时相互合并在一起，使两细胞的胞质沟通，从而造成互相接触的细胞之间发生融合。(3)物理法：电脉冲诱导细胞融合和激光诱导细胞融合[1-3]，电融合诱导法是指利用电场来诱导细胞彼此连接成串，在施加瞬间强脉冲促使质膜发生可逆性电击穿，促使细胞融合的方法。自从1978年Zimmermann首先采用电脉冲方法成功地诱导了细胞电穿孔、电融合以来近三十年里,电穿孔和电融合技术不断发展完善成为一门比较成熟的学科,得到非常广泛地应用。激光诱导融合是利用激光微束对相邻细胞接触区的细胞膜进行破坏 (或扰动),可将两个不同特性、不同大小的细胞在显微镜下实现融合。即利用光镊捕捉并拖动一个细胞使之靠近另一个细胞并紧密接触,然后对接触处进行脉冲激光束处理,使质膜发生光击穿,产生微米级的微孔。这样,由于质膜上微孔的可逆性,细胞开始变形融合,最终成为一个细胞。1987 年和1989年德国海德堡理化研究所用准分子激光器使油菜原生质体融合,从开始照射到完成融合仅需几秒钟,对融合产物观测,发现胞质仍在运动,说明融合后的细胞仍能存活。

激光微束融合法与以前的病毒法、PEG法、电融合法相比较,可选择任意两个细胞进行融合,易于实现特异性细胞融合,作用于细胞的应力小,定时、定位性强,损伤小,参数易于控制,操作方便,可利用监控器清晰地观察整个融合过程,实验重复性好,无菌,无毒性。

1.3 目前细胞融合技术取得的成果 细胞融合作为细胞工程学中一项重要技术已在生物学各个分支科学及医学中的肿瘤学，病毒学，免役学等领域中得到广泛应用。例：在医学上现时最诱人的是单一特异性抗体的生产，1981年美国Hybriteck公司首先实现用单一特异抗体作临床诊断[3]。在育种上,利用细胞融合技术将耐寒的马铃薯与不耐寒番茄的原生质融合得到地上长番茄地下长马铃薯的新品种等，通过细胞融合技术已成功地进行种内、种间细胞的杂交，甚至打破植物之间的界限，取得了植物细胞原生活体与鼠的宫颈癌Hela细胞杂交的成功。动物细胞融合技术可用于研究细胞的核质关系、揭示疾病发生的机制用于衰老机制研究；动物细胞融合用于动物育种。动物体细胞融合后,杂种细胞一般难以发育再生为一个个体,但借助于细胞核移植的方法将融合后杂种细胞的细胞核移入去核成熟卵内,可培育出新的杂种；动物细胞融合用于生产单克隆抗体。有研究应用细胞融合技术和酶连免疫技术成功制备出一种新基因Urg11的抗体；动物细胞融合用于细胞疗法[3]。SCNT(somatic cell nu-clear transfer)将患者的任何体细胞与去核卵细胞融合,融合子进行有丝分裂形成囊胚,囊胚的内细胞团是多能干细胞,对多能干细胞进行诱导使其定向分化可形成所需的组织和器官用于器官移植,不仅解决了器官和组织来源问题,而且避免了宿主对外来物的免疫排斥。经过近几十年的迅速发展，细胞融合技术成为了细胞工程的核心基础技术之一，已在农业、畜牧业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果，而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不仅为核质相互关系、基因调控、质粒转染、遗传互补、肿瘤发生、基因定位、亚细胞生物分子研究、衰老控制等理念领域的研究提供了有力的手段，而且在遗传学、动植物远缘杂交育种、发生生物学、免疫医学以及医药、食品、农业等方面都有广泛的应用价值。特别是在动植物新品种的培育、单克隆抗体的制备、哺乳动物的克隆以及抗癌疫苗的研发等技术中细胞融合技术已成为关键技术。

理论上可以说利用细胞融合技术可以使任何2个细胞通过体细胞杂交融合而形成新的生物资源。

1.4 通过利用细胞融合技术获得大量目的细胞的案例 沈继红等[4]利用细胞融合技术,将生长迅速的异养微藻四鞭藻和富含EPA和DHA的自养微藻绿色巴夫藻相融合,并筛选出兼养的融合藻株。经检测融合藻株的总脂、EPA、DHA和EPA/DHA等指标均比异养亲本四鞭藻有较大提高且在兼养条件下生长速率高于亲本微藻。杨超一等[5]用促卵泡激素(FSH)抗原免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,经细胞融合、筛选、克隆化培养及通过小鼠腹水的诱发，共获得11株FSH单克隆抗体。王琴等[6]以纯化的新城疫病毒ND35免疫Balb/C小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合。经筛选,获得5株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。雷慧芬等[7]将人巨核祖细胞和胃癌细胞融合成功的获得了能产生血小板的融和细胞。焦奥等[8]通过电融合法构建将肝细胞系及原代内皮细胞融合,成功获得了一株由大鼠肝细胞系BRL-3A与原代大鼠胰岛内皮细胞融合而成的四倍体BRL-ies细胞。这株细胞既有内皮细胞表型，表达CD31，又有肝细胞特性，表达较高水平的谷氨酰胺合成酶。祭芳等[9]将玉米赤霉烯酮与羧甲氧基胺半盐酸盐反应，合成半抗原 ZEN-oxime，通过活泼酯法将半抗原与载体蛋白偶联制备玉米赤霉烯酮人工抗原，以人工抗原 ZEN-BSA 免疫 BALB/C 小鼠，将获得的该鼠脾细胞与 SP 2/0 鼠骨髓瘤细胞融合，成功得到了1株能稳定分泌抗玉米赤霉烯酮抗体的单克隆细胞株 3D10。曾柏全等[10]为获得具有高纤维素酶活性且强抗逆性的新菌株，通过双亲灭活原生质体技术对青霉菌与枯草芽孢杆菌进行原生质体融合，成功选育出具有抗逆性的高产纤维素酶菌株。赵晓燕等[11]利用双亲灭活原生质体融合技术，将具有杀虫作用的苏云金芽胞杆菌 B7 和枯草芽胞杆菌 TL2进行融合再生，再生融合子经过十次传代和显微镜检产晶体情况初步筛选出 17 株性状稳定且均能产生杀虫晶体的融合子,通过对黄瓜枯萎病和辣椒疫霉病的拮抗试验，筛选出 3 株(TLB1、TLB2、TLB15)和亲最终筛选出对小菜蛾 2 龄幼虫校正死亡率最高的融合子 TLB15。

2 脐带间充质干细胞(UCB-MSCs)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞。MSCs在特定诱导条件下可分向多种中胚层来源的组织细胞分化,如骨、软骨、脂肪、心肌组织等[12-16]。不同来源的MSCs均不表达主要组织相容性复合体-Ⅱ(major histocompatibility complex,MHC-Ⅱ)类分子和凋亡相关受体FasL，不表达共刺激分子B7-1、B7-2，低水平表达或不表达MHC-Ⅰ类分子、CD40和CD40L，因此其具有低免疫原性[17]。而且与胚胎干细胞相比MSCs不存在伦理约束，基于其独特的分化能力和低免疫原性，MSC在再生医学及疾病的临床应用治疗中起到了很大的作用。如王慧君等[18]用毛囊培养上清液为条件培养液诱导大鼠BM-MSCs，并对诱导后的细胞进行细胞角蛋白15(cytokeratin15,CK15)的免疫细胞化学染色和免疫荧光细胞化学染色，RT-PCR鉴定诱导后细胞CK15的表达，结果显示BM-MSCs经毛囊上清液诱导后部分细胞CK15表达阳性，RT-PCR检测到CK15mRNA的表达，推断体外培养的BM-MSCs经毛囊培养上清液诱导可以分化为毛囊干细胞样的细胞。李海红等[19]将BrdU标记的大鼠BM-MSCs经阴茎静脉输注到大鼠体内，取术后3 d及7 d的创面组织行BrdU免疫组织化学单染色，以及BrdU和广谱CK免疫组织化学双染色，结果BrdU阳性细胞出现在创面皮下组织、皮脂腺、毛囊中，免疫组织化学双染色结果显示皮脂腺和毛囊有BrdU阳性细胞，验证了在实验性全身皮肤缺损创面微环境下，MSCs可分化为皮肤附属器细胞。

目前临床应用较多的为骨髓来源MSC(bonemarrow-MSC,BM-MSC)、脐带来源MSC(umbilicalcord-MSC,UC-MSC)和脐血来源MSC(UCB-MSC)，不同来源MSC虽然具有一些共性，但也具有一些不同的特性[20]。脐带是连接胚胎脐部和胎盘的索状结构，外有羊膜包被，内有来自中胚层的胶样结缔组织。结缔组织内包括闭锁的尿囊、卵黄蒂、两条脐动脉和一条脐静脉。胶样结缔组织被称为华通胶或沃顿胶(Wharton’sjelly,WJ)。它富含胶质和葡萄糖胺聚糖(主要为透明质酸)。McElreavey等[21]首次报道了在人脐带WJ组织中分离并培养出一种成纤维样细胞，其能够向多个方向进行分化。随后众多研究者也展开了对UC-MSCs的研究，结果发现其表面标志物与BM-MSCs相似，只是CD106表达率略低。研究发现，脐带中含有丰富的MSCs，比骨髓和脐血更为丰富，其增值能力也比成人骨髓MSC更强，并且UC-MSCs与BM-MSCs相比较，具有相似的细胞表面标志物，它多采用组织块法培养，7～10 d既可长出大量间充值干细胞[22,23]。与其他来源干细胞培养方法相比，其方便、简单、细胞贴壁快，更易获脐血干细胞得原代细胞，无其他细胞混杂，纯度高，是潜在的MSC的重要来源。另有研究证实，UC-MSCs与BM-MSCs免疫原性相比较，BM-MSCs表达组织相容性复合物MHC-I和较弱的MHC-Ⅱ，但UC-MSCs只表达MHC-I，且表达率低于BM-MSCs，不表达或低表达抑制免疫排斥相关的共刺激因子CD80,CD86,CD40,CD40L等，免疫原性较BM-MSCs更低，更加适宜用于临床上同种异体间移植治疗[24,25]。

3 汗腺细胞

一般来说人体有(3～4)×106个汗腺组织，汗腺属于外分泌腺，汗腺根据其体积的大小分为两种，大的称为大汗腺又叫顶泌汗腺，小的称为小汗腺即通常说的外泌汗腺。大汗腺主要分布于腋窝、乳晕、肛门和会阴等处。小汗腺分布于全身大部分皮肤中由分泌部和导管部组成，其腺体直接开口于皮肤是人体发汗的主要器官。

从胚胎学上来说，汗腺起源于外胚层上皮细胞，其通过分裂、增殖、内陷在表皮脊形成上皮细胞索，随后近端发育成导管，末端发育成分泌部，中间形成空隙联通导管和分泌部，从而构成汗腺。一般来说整个发育起于胚胎14～16周，到胚胎24周时形态结构趋于稳定[26]。整个过程复杂有各种生长因子参与其中，如成纤维细胞生长因子、转化生长因子和表皮细胞生长因子等可以促进有丝分裂，加速汗腺细胞增殖，诱导汗腺胚芽的发生[27]。

汗腺的主要功能是分泌汗液，从而实现体温的调节，整个排汗过程是由交感神经支配的，外科交感神经切除术证实胆碱能神经纤维起源于交感神经元的颈上神经节[28]，成人汗腺细胞表达CK7、CK8、CK18、CK19于类上皮细胞相似[29]，Turksen等[30]发现一种汗腺特异性蛋白，仅存在于外泌汗腺。目前还没有发现汗腺细胞的特异性标志。研究发现CEA在在胎儿和成人皮肤的汗腺导管部、分泌部均有表达，在表皮的其他部位不表达[29]。CK19是上皮细胞的特异性抗原标志物，作为表皮干细胞鉴定手段之一，在汗腺导管部细胞中也有表达[31]。因此，以往实验通过CEA与CK19的免疫组化表达情况检测汗腺细胞的表面标志物。

4 类汗腺细胞

4.1 目前获得类汗腺细胞的主要方式是通过干细胞诱导技术 干细胞技术是通过干细胞移植诱导再生汗腺。间充质干细胞在特定诱导下可以向多种中胚层来源的组织细胞分化,具有潜在的分化为汗腺样细胞的能力。将骨髓间充质干细胞在体外与热休克后的人汗腺细胞共培养，可以被诱导成为具有汗腺细胞表型的细胞。直接共培养——将热休克的汗腺细胞和间充质干细胞直接放入培养皿中一起培养。间接共培养——将热休克的汗腺细胞培养基的上清液加入到间充质干细胞的培养皿中诱导培养。小室共培养——将热休克的汗腺细胞和间充质干细胞放到小室的不同层次共同培养。这说明热休克细胞分泌的某种物质可以诱导间充质干细胞的定向分化。随着近几年众多学者对汗腺再生相关研究的不断深入，汗腺形态的多基因及信号通路的机制逐渐得到证实。多种细胞因子和信号转导途径参与了汗腺再生过程，并在汗腺发育过程中发挥重要的调节作用。此外，不同的细胞因子可激活相同的信号转导途径，而同一种细胞因子又可激活不同的信号通路，并且不同的信号通路之间有复杂的相互作用。目前明确的相关因子和信号转导途径有miRNA-203、P63、EDA-A1、microRNAs、NF-κB、Lef-1、外胚叶发育不全因子(EDA-A1)、重组人表皮生长因子(rh-EGF)和胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠(ITS)、PD98059、胞外信号调节激酶(ERK)信号通路、EDA-A1/EDA-A1受体信号通路、NF-κB信号通路、Wnt/β-角蛋白(β-catenin)信号通路、Shh信号通路、骨形态发生蛋白(BMP)信号通路等，但是汗腺再生是一个复杂的多基因及信号通路参与的过程至今没有完全研究清楚。共培养虽然可以诱导间充质干细胞向汗腺样细胞定向分化，但是共培养的前提需要大量的热休克汗腺细胞，目前解决不了这一问题。

4.2 目前未能获得具有分泌汗液功能的组织工程皮的主要制约瓶颈 目前通过三维培养等技术研制出的全层皮肤替代物已有许多种，已成功解决大面积烧伤患者自体皮源不足的问题，但笔者发现至今还没有任何一种组织工程皮能作为理想的皮肤覆盖物，是因为这些全层皮肤替代物缺乏皮肤附属物，毛囊、皮脂腺尤其是汗腺。周立奉等[32]将汗腺上皮细胞以接种至Matrigel凝胶进行三维立体培养，成功形成了汗腺样结构，但汗腺细胞自身的阔增是极其缓慢的，近年来众多学者试图利用组织工程学培养皮肤附属物汗腺组织的尝试一直没有间断过，但目前仍然没有可靠的方法培养出大量汗腺细胞，这严重阻碍了构件能分泌汗液组织工程皮的进展。如何获得大量汗腺细胞是目前首要解决的重点和难点。

4.3 通过构建汗腺细胞和人间充质干细胞来获得大量具有分泌液功能的融合细胞的新进展 2003年国外学者首次提出间充质干细胞分化为汗腺细胞的机制可能是直接分化，也可能是与汗腺细胞发生融合，甚至是核融合[33]。李海红等[34]在研究人骨髓间充质干细胞在体外与损伤的人汗腺细胞共同培养时的转化情况中发现了间充质干细胞和汗腺细胞融体，且做了相关检验证明了融合细胞同时表达间充质干细胞和汗腺细胞两个亲本的表型。周岗[35]汗腺发生与修复过程中基因表达特征的系列研究中再次证实了间充质干细胞和汗腺细胞融体，且做了相关检验证明融合细胞同时表达间充质干细胞和汗腺细胞2个亲本的特异性抗体。李海红等[36]对人骨髓间充质干细胞表型转化为汗腺细胞的体外研究时也再次证实了间充质干细胞与汗腺细胞发生融合形成多核细胞。至今融合细胞同时两个亲代细胞的表型已是不争的事实。多个学者发现已分化的体细胞能够通过重编程转化回多能干细胞,在细胞移植、疾病细胞模型的制备以及药物筛选等领域具有重要意义。通过干细胞和体细胞的细胞融合,可使体细胞重编程[37,38]。细胞融合致体细胞重编程速度快、效率高,是一种研究重编程机制的重要手段。这也同样说明用间充质干细胞和肿瘤细胞一样用于细胞融合技术来改变亲本细胞的特性，从理论上说明其是可行的。

综上所述，实现汗腺再生具有很大的临床价值，但汗腺细胞分化是一个复杂的过程，机制尚不明确，需要进一步深入研究。间充质干细胞和汗腺细胞融合体的首次发现是无意中实现的，但融合体的检测结果给了我们一个实现汗腺再生新的启示。再生医学是现代医学发展的趋势，细胞融合技术作为再生医学的重要技术手段可把来自于不同种生物的单个细胞融合成一个细胞，使这个新细胞(杂合细胞)得到了来自两个细胞的遗传物质(包括细胞核的染色体组合和核外基因)，具有新的遗传或生物特性。脐带间充质干细胞以其原代培养简单、易获得、纯度高、低抗原性更加适宜用于临床上同种异体间的移植。这从理论上说，用细胞融合技术把干细胞和汗腺细胞融合来获得大量具有分泌汗液并可适当扩增的杂合细胞是可行的。深入研究构建人间充质干细胞和汗腺细胞融合体来获取大量具有分泌汗液功能杂合细胞的新方法，将细胞融合技术、细胞生物技术与生物材料工程学相结合是开发理想组织工程全层皮肤的新发展方向。