细胞外囊泡的生物学特性及其在缺血性脑卒中诊疗中的价值

周志文 综述 钟望涛 审校

广东医科大学附属医院神经内科，广东 湛江 524000

随着人类平均寿命的逐渐延长，脑血管疾病在人类疾病谱中占据的比例越来越大。美国心脏协会最近的统计数据指出，全球每年有630 万人死于脑血管疾病[1]。我国最新的全国死亡原因调查结果显示，脑卒中已超过恶性肿瘤成为中国首位死亡病因；脑卒中是脑血管疾病的最常见类型，包括缺血性和出血性脑卒中，其中前者占87%左右[2]。缺血性脑卒中具有发病率高、致残率高、死亡率高等特点，随着老年化的逐渐严重，其不仅给家庭甚至给社会带来巨大的精神及经济压力[3]。目前国际上对缺血性脑卒中病因分型广泛采用TOAST 分型，包括大动脉粥样硬化型 (LAA) 、心源性栓塞型 (CE) 、小动脉闭塞型 (SAA) 、其他明确病因 (SOE) 及不明原因型 (SUE) 等5个类型[4]。然而，缺血性脑卒中致病机制仍不十分明了。近年来随着对EVs的深入研究，预示着EVs 在缺血性脑卒中的发生、发展及预后等过程中发挥着不可或缺的作用，为缺血性脑卒中致病机制的探索指出新的方向。

1 细胞外囊泡的生物学特点

1.1 细胞外囊泡的定义 细胞外囊泡 (extracellular vesicles，EVs) 是由细胞在生理及病理状态下对外分泌的纳米级亚细胞结构的小囊泡[5]。根据EVs的直径大小，主要分为3 个类型： (1) 外泌体 (直径20～150 nm) ； (2) 微粒 (直径100～1 000 nm) ； (3) 凋亡小体 (直径1 000～5 000 nm)[6]。根据EVs 的细胞来源，可分为血小板源性细胞外囊泡、内皮细胞源性细胞外囊泡、红细胞源性细胞外囊泡等。目前学术界对EVs 的分类仍未达成统一的标准，其中由EVs 直径大小定义EVs 亚群仍存在争议，因为EVs 的大小分布有一部分是重叠的，导致亚群分离出现误差[6-7]。有学者通过鉴别在EVs 聚集的蛋白，并定义了一组在不同EVs 中显示不同相对丰度的5 种蛋白，证明了EVs 中存在外体亚型和非外体亚型，并提出了利用CD63、CD81 或CD9 免疫分离它们的差异分离方法[7]，这就提示EVs直径大小联合蛋白质组标志物来定义EVs 亚型更具特异性。

1.2 细胞外囊泡的分泌及生物学功能 细胞是通过不同形式来分泌外泌体、微粒、凋亡小体的。外泌体是由细胞膜内吞形成小泡，这些小泡聚集在多泡体中逐渐成熟，并以胞吐的形式从母细胞分泌出来[8-9]。微粒是由质膜直接向外出芽和分裂形成的，其分泌过程相对简单[9-10]。细胞在分泌微粒和外泌体的过程中并不是绝然不同的，也有一些共同之处，如微粒和外泌体的分泌过程均包括聚集、出胞、切断和释放4 个环节，同时微粒和外泌体上的跨膜蛋白与质膜上的跨膜蛋白的拓扑结构保持高度一致性[5]。凋亡体是由死亡细胞的分裂形成的[11]。EVs 包含多种蛋白质、脂质、DNA、RNA 等物质[12-13]，这些物质来源于母细胞，具有母细胞的诸多功能，如血小板源性的微粒和外泌体比激活的血小板具有数十倍的促凝功能[14]。在不同的病理机体中，细胞产生的EVs 数量、种类及其携带物质 (蛋白质、DNA、RNA等) 均有所差异，并通过体液循环把信息传递给远端细胞[11，15]，从而参与机体的免疫应答、炎症反应、新生血管的形成、血栓形成等病理过程中[16]，在信息传递过程中起到桥梁的作用。

2 细胞外囊泡作为生物学标志在缺血性脑卒中的作用

近年来，随着对缺血性脑卒中患者循环EVs 的广泛深入的研究，发现EVs的种类、表型、数量与缺血性脑卒中的类型、危重程度及预后等存在一定内在联系。血管内皮细胞的功能障碍及血小板的激活促凝在缺血性脑卒中的病理生理过程中扮演着重要的角色。而EVs 则主要反映其母细胞的功能状态[17]，因此内皮细胞和血小板来源的EVs 更有望成为反映缺血性脑卒中患者病情危重程度及预后等情况的生物标志物。

2.1 微粒在缺血性脑卒中的生物学标志 不同的病理状态下，机体产生的EVs 的种类、表型及数量等都有所差异。有学者提出，在凋亡的刺激下，CD31和CD105 在内皮细胞微粒 (endothelial microparticle，EMP) 上表达有所增加；在细胞激活的过程中，EMP表达CD54、CD62E和CD106有所增加[18]。此外，在急性病理状态下，CD31 EMP 能反映内皮细胞新近受损的情况，而在慢性病理状态下，CD51 EMP则能反映内皮细胞中远期的损伤情况[19]。LI等[20]通过研究分析缺血性脑卒中OCSP 分类与CD62E+EMPs 之间的关系，发现CD62E+EMP 值具有预测卒中亚型的潜能。JUNG等[21]发现缺血性脑卒中患者NIHSS 评分的高低和梗死体积的大小与CD62E+EMP 水平存在明显的正相关，同时还发现CD62E (+) 与CD31 (+) /CD42b (-) 或CD31 (+) /AV (+) EMP比值可协助判定颅内外动脉狭窄程度。与正常对照组相比，缺血性脑卒中患者的CD62E+EMPs升高，且在较长的时间内仍处于较高水平[22]。对于这些发现，EL-GAMAL 等[23]提出了以下假设，首先，高水平的CD62E+EMPs 与脑卒中发病时间无关，表明内皮细胞持续活化；其次，缺血性脑卒中内皮功能障碍更可能是由于细胞活化而不是凋亡引起。因此CD62E+EMP能否作为缺血性脑卒中患者复发时的生物标志物，需要进一步深入探究。多个研究发现，CD144+EMPs 与卒中严重程度呈正相关，特别在中重度卒中患者中CD144+EMP值升高明显[20，24]，这将有利于临床早期快速判断卒中患者病情的危重程度。此外，另一个值得关注的是，CD105+CD144+EMP计数在出血转化的患者中升高，这具有诊断脑梗死出血转化的潜在价值[24]。与此同时，血小板微粒 (platelet microparticles，PMPs) 在缺血性脑卒中的诊断价值也不可忽视。大量的研究表明，相对于正常对照组，脑卒中患者循环PMPs 水平较高[25-26]，这意味着PMPs将可作为诊断的生物标志物运用于卒中。LAA和SAA两型脑卒中患者的PMPs水平均高于正常对照组、CE和SUE脑卒中患者[25-26]，PMPs似乎能够成为区分脑卒中类型的良好生物标志物。BIVARD 等[27]发现，在超急性期接受阿替普酶静脉溶栓治疗的卒中患者中，其循环CD41+PMP 的水平与脑血管再通及3个月后Rankin评分的改变存在显著相关性，这使其成为评估脑卒中患者血管再通的一个潜在候选指标。

2.2 外泌体在缺血性脑卒中的生物学标志 外泌体水平不仅在不同的疾病条件下会有所不同[28-29]，同时在同一疾病不同时期也有所不同[30-31]，因此外泌体也是疾病不同病理生理状态下的一类潜在候选指标。miRNA 是真核细胞中非蛋白编码的小核糖核酸分子，其几乎参与调控生物体生命周期所有的生物变化，因此EVs的miRNA含量提供了一个重要的生物标志物来源。通过观察大鼠脑组织在不同缺血时间条件下rno-miR-122-5p 和rno-miR-300-3p 水平变化情况，LI等[32]发现相对于正常组和5 min组，10 min组大鼠循环外泌体rno-miR-122-5p表达明显下降；与正常组、10 min组和2 h组相比，5 min组大鼠循环外体rno-miR-300-3p上调较明显，因此他们提出循环外泌体rno-miR-122-5p联合rno-miR-300-3p可作为TIA的生物标志物。随后LUO等[33]通过类似的大鼠模型实验发现，10 min组大鼠循环外泌体rno-miR-450b-5p表达水平较正常组、5 min组和2 h组上调明显，提示循环外泌体rno-miR-450b-5p同样对短暂性脑缺血发作 (TIA) 具有较高的诊断价值。上述外泌体miRNA对TIA的诊断价值仅限于动物实验，运用于临床仍需要大样本临床试验来验证。外泌体RNA不仅对TIA诊断提供新的参考指标，而且在区分缺血性卒中的类型、预判其危重程度及预后等方面均具有良好临床运用价值。临床实验表明，在急性期，缺血性卒中患者循环外泌体miR-223表达显著升高，而且与病情危重程度及其预后存在明显的相关性，提示循环外泌体miR-223可作为评估缺血性脑卒中的危重程度及预后的新指标[34]。LI等[28]通过检测分析缺血性脑卒中患者急性期和亚急性期的循环外泌体miR-422a和miR-125b-2-3p表达水平发现，随着时间推移两者表达水平下调而且下降幅度较明显，因此血浆外泌体miR-422a联合miR-125b-2-3p对判定缺血性脑卒中的分期具有重要的临床意义。此外，有研究表明循环外泌体miR-21-5p联合miRNA-30a-5p具有诊断缺血性脑卒中及区分其分期的潜力，为临床早期确定缺血性脑卒中及在其溶栓治疗提供新的参考指标[35]。

3 治疗

脑组织是人体代谢最活跃的器官，其能量主要由糖的有氧代谢提供，而无能量储存，因此神经系统对缺血缺氧极其敏感，脑细胞可在极短时间内受到损害甚至死亡。目前对于缺血性脑卒中的治疗主要集中在超急性期再灌注治疗 (溶栓及动脉取栓) 、急性期的病因和发病机制治疗、恢复期的功能训练及二级预防等，然而超急性期治疗严格受时间限制，急性期药物疗效差强人意，迫切需要新的药物和新的治疗方法来改变目前治疗的困境。随着近几年对EVs的研究，有人发现EVs 在促进组织血管和受损细胞的再生和修复[36]、调控受损细胞的代谢及凋亡[37]等多个环节影响着疾病预后，为今后治疗缺血性脑卒中研制新药物奠定了理论基础。

3.1 天然的细胞外囊泡作为药物治疗缺血性脑卒中 EVs 不仅具有母细胞的生物学功能，同时还兼备有母细胞不可比拟的诸多优点，如免疫原性低；无血管阻塞作用，降低继发性微血管血栓形成风险；能够穿越血脑屏障进入脑实质[38]。同时EVs的磷脂双分子膜结构使其生物活性物质与内环境隔绝，避免被降解的命运。因此EVs 具有治疗缺血性脑卒中的巨大潜力。RIAZIFAR 等[39]总结了前人的研究发现，在各系统脏器疾病的小鼠模型中，EVs 均具有促进组织再生的能力，甚至在卒中模型中也有良好的修复作用。早期动物实验表明，活化的PMPs 含有多种促生长物质，可激活神经祖细胞和促进神经血管重构，可用于脑卒中治疗[40]。此外，内皮细胞微粒对血脑屏障完整性和脑血流有不同程度的调节作用，也可作为缺血性脑卒中治疗的靶点之一[41]。一项动物实验表明，M2小胶质细胞来源的外泌体通过外泌体miR-124 及其下游靶基因USP14可减轻缺血性脑损伤，提高神经细胞的存活率[43]。干细胞是一类能够自我更新及多能分化的细胞，具有治愈所有疾病的潜能，被誉为21 世纪最有前景的生命科学之一。近年来，干细胞来源的EVs在疾病治疗方面的作用逐渐引起学者的关注。DENG等[45]指出，骨髓间充质干细胞 (BMSCs) 来源的外泌体miR-138-5p过表达能够促进缺氧葡萄糖剥夺，抑制星形胶质细胞凋亡，而且能够下调脂钙蛋白2表达，减少炎症因子的分泌，更重要的是，BMSCs 通过外泌体向星形胶质细胞传递miR-138-5p 减轻了卒中小鼠神经元损伤。脂肪源性干细胞 (ADSC) 衍生的外泌体可减少神经细胞的死亡和促使神经细胞的增殖，促进脑功能恢复，更重要的是，与单纯外泌体治疗相比，miR-126+外泌体治疗进一步增强了这些结果[44]。此外，另一项研究表明，mir-30d-5p强化的ADSC分泌的外泌体通过抑制自噬和促进M2小胶质细胞/巨噬细胞极化，可显著降低脑梗死面积[45]。

3.2 细胞外囊泡作为药物载体治疗缺血性脑卒中 相对于其他现有或潜在的药物载体，EVs 具有循环稳定性好、免疫原性低、传递效率高、无血脑屏障障碍等优点[38]，同时可以根据治疗的需要，可对EVs与治疗性小分子进行体外的有机结合[46-47]，使药物的剂量减少，副作用减轻，药效更佳。因此EVs 作为药物载体在治疗卒中同样具有广泛的前景。为解决细胞外囊泡加载药物的技术难题，生物学家已探索出多种细胞外囊泡装载外源性物质的技术，如电穿孔技术、生物转染技术、基于化学的外泌体转染技术、选择性外泌体加载技术[48]。例如姜黄素加载到外泌体，然后经鼻给药缺血-再灌注损伤小鼠模型，Kalani团队发现小鼠缺血再灌注损伤后的神经功能评分、梗死体积和水肿有所改善，提示姜黄素包膜外泌体能够帮助小鼠缺血-再灌注损伤后的神经血管恢复[49]。然而，现有的EVs 加载技术虽然能够装载外源性药物，但是其靶向性不足限制了其临床应用。为了提供外泌体的精准运输能力，有学者提出C肽偶联到外泌体表面的方法，并观察到C肽偶联外泌体作为运载体运载姜黄素可强烈抑制脑缺血损伤区域炎症反应和细胞凋亡[50]。此外，类似的实验证明了C肽偶联外泌体作为运载体可提高缺血脑病变区域miR-210的浓度，使脑缺血后脑组织修复得到更好的改善[51]。

4 结语

在缺血性脑卒中发病前后，EVs 均发挥着不可或缺的作用，具有反映缺血性卒中类型、危重程度及预后等情况的巨大潜能，但具体的发病机理仍未探明，阻碍其应用于缺血性脑卒中的临床诊断。此外，EVs在缺血性脑卒中发生后具有促进神经血管恢复等功能，同时具有免疫原性低、循环稳定性好等优点，EVs也表现出治疗缺血性卒中的巨大潜能。现阶段，EVs作为药物载体治疗缺血性脑卒中仍面临诸多难题，譬如如何提高EVs 装载外源性药物的效率和如何提高EVs 运载体精准运输的能力。同时，EVs 的分离提纯是治疗缺血性卒中的必要前提，然而现有的分离提纯EVs 的技术仍有待进一步改进。因此，EVs 在诊断和治疗缺血性脑卒中等方面的研究仍有较多的技术瓶颈要攻克。