诺如病毒检测技术的研究进展

孙志强,黄志成,王 修,陈 健

(吉林省肿瘤医院,吉林 长春130012)

诺如病毒(NV)，是人类杯状病毒科中诺如病毒属的一种病毒，是一组形态相似、抗原性略有不同的病毒颗粒。在全球均有因诺如病毒感染导致爆发性腹泻的发生，且该病毒易感性强，传播速度快，故寻找到合适方法进行诺如病毒的检测也尤为重要。这也为临床疾病诊断及实验室检查提供了依据。目前通过电镜法、免疫学方法、分子生物学方法、都可以较好地实现对诺如病毒的检测，这为后续诺如病毒感染性疾病的治疗奠定了良好的基础。在诺如病毒的检测中，因反应特异性及灵敏度较高，可检测出诺如病毒的不同分型，使诺如病毒疫苗及治疗药物的研发更加具有针对性，在临床应用方面产生更高价值。因此，检测诺如病毒对疾病的诊断治疗及随后控制传染性疾病的爆发具有高度的指导意义。可见，诺如病毒的检测在实验室及临床研究中都是十分必要的。

1 病毒结构特点

诺如病毒属杯状病毒科，诺如病毒属，基因组长度约7.5-7.7 kb的单股正链RNA病毒，直径约27-37 nm，无囊膜。其5＇端以共价键方式通过病毒末端结合蛋白结合，3＇端有多聚A尾[1]。诺如病毒共有3个开放阅读框，ORF-1编码非结构多聚蛋白，长约5 kb，ORF-2编码主要结构蛋白 VP1，长约1.8 kb，ORF-3编码强碱性微小结构蛋白，长约0.6 kb[2]。该病毒的衣壳蛋白为二十面体对称结构，由180个分子折叠成 90个二聚体构成。衣壳蛋白分为突出区(P区)和外壳区(S区)，其中P区包含P1区和P2区，即拱干和拱顶。P2区因包含血型组织抗原结合序列和碳水化合物结合序列，故其属于最可变区[3]。

2 发病机制

诺如病毒感染传播途径为粪-口传播。其耐酸性较强，故能在人体上消化道定植并复制，其中信使RNA为病毒RNA[4]。诺如病毒受体是位于肠道黏膜表面的人类组织血型抗原。在感染时，人类组织血型抗原和诺如病毒衣壳蛋白VP1的突出区(P)的末端相结合。人类组织血型抗原中存在α-1,2糖基转移酶(FUT2)的个体，更易感染诺如病毒。当人体不表达或缺失编码转移酶的基因时，机体则不感染诺如病毒[5]。

3 检测技术

3.1 电镜法

电镜法为诺如病毒最早检出的方法，因其灵敏度相对较低，同时要求较高的操作技术，故标本中病毒的检测范围须≥106才可检出。因此，并不适用于临床诊断[6]。

3.2 免疫学检测

3.2.1ELISA法 检测诺如病毒主要是通过抗原抗体反应[7]。固相上包被有诺如病毒特异性单(多)克隆抗体，标本中诺如病毒衣壳抗原被捕获后，用标记的抗诺如病毒特异性多克隆抗体进行检测。目前利用此技术的检测试剂盒已被临床广泛应用[8]。Morillo SG等[9]将306例人体粪便标本用RIDASCREEN第三代诺如病毒ELISA检测试剂盒进行检测，结果显示特异性为90.9%-96.4%，灵敏度为43.8%-97.1%。该方法检测诺如病毒节约时间，节约成本，操作简便。检测下限约为105拷贝/ml。ELISA法可能会显示假阴性或假阳性结果，这是由于各种抗原抗体种类及结构不同[10]。因诺如病毒该方法的检测在特异性和灵敏度上仍有欠缺，同时病毒抗原易变异，故在检测中被认定为筛查试验，仍需进行以分子生物学检测为主的确认试验。

3.2.2免疫层析技术 该技术可用于快速检测诺如病毒，结合了免疫亲和作用及层析技术，其优点在于节约时间，操作方便，因此广泛用于临床检测。免疫层析技术是利用试纸条，其上有利用诺如病毒抗原制备的单抗或多抗，来进行检测[11]。Takanashia S等[12]利用该方法检测诺如病毒。检测试剂盒中为以重组样病毒基因亚型GII-3或GII-4为抗原制备的多克隆抗体，标本中病毒复合物在测试线上，可捕获抗体，并与抗体结合后反应。硝酸纤维薄膜上涂有测试线条。用蒸馏水按一定倍数稀释样品，制成10%稀释液，并将等量稀释液与等量缓冲液混合均匀。将试纸条放入检测试剂盒内，混合物在毛细作用下沿条带上升。15分钟后，阳性为两条区带，阴性为一条区带。因其节约成本等优点，多种免疫层析试剂盒已在国外广泛应用。Pombubpa K等[13]利用免疫层析技术检测急性胃肠炎患者粪便中的诺如病毒，此种试剂盒灵敏度可达83.3%，特异性为87.5%。在用于检测诺如病毒的标本中，仍有12.5%的阴性样品被误检为假阳性。因此，临床上在检测诺如病毒时，也常采用分子生物学方法进行检测，并将其认定为诺如病毒检测中的“金标准”。

3.3 分子生物学检测

3.3.1常规RT-PCR 常规RT-PCR技术在临床上应用广泛，灵敏度较高，操作简便，成本较低[14]。此技术是指随核酸扩增，累积扩增产物，在检测中或分析前，随热循环结束即达到平台。利用该技术检测诺如病毒时，可产生PCR产物，将产物进行琼脂糖凝胶电泳，通过不同的长度来鉴别不同的PCR产物[15]。该技术也可区分出诺如病毒不同的类型，通过病毒mRNA的逆转录，即mRNA→cDNA，随后进行PCR扩增实现对目的基因的表达，使检测灵敏度得以提升。同时，进行序列比对，提高试验的特异性[16]。刘翼等[17]在RNA聚合酶基因区以Koopmans引物JV12Y/JV13I来应用RT-PCR技术进行诺如病毒检测，RNA对该区具有依赖性。以358份腹泻患儿粪便为检测标本，对共42份诺如病毒阳性标本抽出11份进行测序，在DNA序列数据库中比对分析，结果表明为诺如病毒。早期，RT-PCR技术会存在样品污染的情况，这是由于扩增产物时需开放环境；同时，此技术在检测诺如病毒时，变异率较高。后因型特异性引物的引进，情况得到大大改善。

3.3.2多重RT-PCR 多重RT-PCR，于相同反应体系，以同一DNA模板不同区段或不同模板进行扩增，同时需要不同的特异性引物。此法可检测出诺如病毒的不同分型。该方法节约时间，节省成本，可同时实现多种病毒检测，但灵敏度不高[18]。Khamrin P等[19]利用多重RT-PCR技术对10种病毒导致腹泻的粪便标本进行检测，设计PCR引物后得到不同长度的扩增产物片段，从而判断不同种类的病毒。Shigemoto N等[20]对71例急性胃肠炎患者的粪便标本进行诺如病毒检测，利用多重 RT-PCR 技术，以诺如病毒衣壳蛋白区及聚合酶区序列设计PCR引物。在确诊了诺如病毒感染的61例标本中，其检出率可达96.7%。Zhang等[21]对两个公司研发的多重检测技术平台进行了调查，即BioFire公司和Luminex 公司。两公司研究开发的薄膜阵列式胃肠检测系统和胃肠道病菌检测系统，均对诺如病毒的检测有效，且检测灵敏度有所提升。此类应用多重RT-PCR技术的检测系统，可广泛应用于在多种病原体之间诺如病毒的检测。应用此类系统时，操作迅速，且样品处理时间短[22]。多重RT-PCR技术的广泛应用，对诺如病毒感染性疾病的检测和临床诊断都有重要的指导意义。

3.3.3荧光RT-PCR 荧光RT-PCR，即目标探针耦联有荧光染料，用来检测所生成的不同核酸，其中目标探针具有特异性。扩增产物在反应阶段的任何PCR循环中均可产生，且具有较高的特异性和灵敏度[23]。诺如病毒中存在一靶向引物，可参与反应对诺如病毒基因型进行检测，且反应灵敏，迅速。该引物位于基因区最保守的区域，即开放性读码框ORF1/2连接区[24，25]。虽然是在最保守区域，诺如病毒单核苷酸千变万化，且无法估计，同时，根据此区域设计的探针和引物在检测诺如病毒的突变株时是否具有相同的反应灵敏性，这也无法保证[26]。故在不同的检测过程中，应适当调整探针和引物。Miura T等[27]应用荧光RT-PCR技术，对几组粪便标本中3种不同的诺如病毒同时进行检测。反应阶段设计3对不同的引物，在荧光染色过程中，应用相同荧光染料，可以使反应的特异性和灵敏度大大增强。这是由于此方法可叠加3种基因组不同诺如病毒的荧光信号。与其他RT-PCR技术的检测结果相同，粪便标本中可检测出诺如病毒。现已根据此技术研发出多种检测试剂盒，如德国RIDAGENE试剂盒，其可检测出多种不同分型的诺如病毒[28]。现已进行的诺如病毒GIV型荧光RT-PCR检测，在全世界临床检测诊断及实验室研究中已大规模应用[29,30]。

4 小结

在诺如病毒的检测中，电镜法因灵敏度较低，操作要求较高，而不被广泛使用。免疫学方法操作简便，并且可节约时间，可进行诺如病毒的初步筛查及快速检测，但其灵敏度及特异性仍欠佳。分子生物学法被认定为诺如病毒检测的“金标准”，具有良好的特异性及灵敏度，检测结果也较为准确，但技术水平要求相对严格。为了更准确地检测诺如病毒，目前实验室研究中尝试利用基因芯片，基因探测等方法进行诺如病毒的检测。同时，可应用互联网系统，不同实验人员检测不同标本不同分型的诺如病毒时，可将特异性较强的检测结果输入到系统中，建立诺如病毒数据库，增加样本的多样性，供研究人员进行比对分析，从而研制出新的诺如病毒疫苗。但是，目前研究还面临着一定的问题，例如人体感染诺如病毒后，是否在病毒迅速繁殖的过程中，机体出现了强耐药性或是否免疫力发生了改变等。因此，诺如病毒的检测技术仍然存在不足。最重要及最有效的方式仍是采取一定行动，加强对诺如病毒的预防，并减少诺如病毒的传播。