高通量测序技术在感染性疾病中的应用进展

朱诗鸣 ，陈瑞琳，王真 *

（1.浙江中医药大学第一临床医学院，浙江 杭州310053；2.浙江中医药大学附属第一医院，浙江 杭州310006）

高通量测序技术（next-generation sequencing，NGS）又称“二代测序技术”，是相对于第一代DNA测序技术而言的新型测序手段。1977年Sanger等[1]发明了双脱氧核苷酸末端终止法，标志着第一代测序技术的诞生。到目前为止，第一代测序技术已被广泛应用于生命科学研究工作中，传统的第一代测序技术具有高度准确性和简单、快捷等优点，但有测序反应时间较长、测序通量低、成本高等缺点，仅适用于小样本遗传疾病基因的鉴定，难以完成没有明确候选基因或候选基因数量较多的大样本病例筛查；随着分子生物学研究的不断发展和深入，我们迫切需要更高通量的核酸测序手段进行检测[2]。基于此，第二代测序应运而生。2005年Meyer等[3]报道了基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，开创了高通量测序技术的先河。

高通量测序技术具有通量高、敏感性高、价格低廉等优势，有较强的应用前景，目前已广泛应用到遗传病学、肿瘤标志物检测等多个方面。2014年Wilson等[4]报道了1例应用高通量测序技术对脑脊液进行检测，最终诊断为钩端螺旋体感染，标志着高通量测序技术对微生物检测应用的开始。近年来，高通量测序技术在微生物和感染性疾病的诊断中发挥了巨大作用，现将其在这一领域的应用作如下综述。

1 高通量测序的优势

1.1 较广的病原体检测范围

传统微生物感染的确诊主要依赖于临床微生物实验室的培养结果，但是受临床采样、培养条件和抗生素使用等影响，培养阳性率较低。假设驱动的分子检测技术（例如PCR）只能针对特定目标生物进行单独检测，稀有病原体遗漏和引物不匹配降低了其敏感性，而高通量测序技术对病原体的筛查是直接从样本中获得病原体的核酸序列信息，再通过生物信息学的方法对得到的序列进行比对分析。基于生物样本库的庞大，其检测方式决定该技术检测范围，涵盖细菌、病毒、真菌、寄生虫、支原体、螺旋体等典型或非典型病原体。高通量测序技术依靠其无偏倚、随机的特性不仅可以检测已知病原体的基因组，更可以从头组装未知微生物的基因组，后者对新发病原体感染鉴定发挥重要作用。该技术广泛应用于检测呼吸道、神经系统、血液、胃肠道及眼部等感染[5]。

Yun等[6]对ICU 78例血浆标本同时进行高通量测序和传统培养检测，结果表明，在细菌及真菌方面，最终有8份标本培养及测序均阳性，3份标本培养阳性而测序阴性，9份标本培养阴性而测序阳性。此外，通过二代测序还在14份血样中检测到15种病毒，且均通过第一代桑格法测序验证。整体诊断灵敏度显著增加。Yun等[7]对178例重症肺炎患者采用高通量测序进行检测，结果表明高通量测序可以提供更快速准确的病原学结果，能检测出肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、产黑色普式菌等传统培养较难检测的细菌。临床根据检测结果调整了治疗方案，患者28天和90天的生存率均有提高。

Yao等[8]首次报道了高通量测序技术在中枢神经系统李斯特菌感染中的应用，对3例进行了脑脊液检测，其中2例脑干炎与1例脑膜炎，单核细胞增生性李斯特菌序列数范围在74-665，覆盖度为0.28%～2.4%，3例均通过了PCR或细菌学验证，将NGS的临床应用拓展到中枢神经系统细菌感染的诊断中。神经囊虫病是中枢神经系统中最常见的寄生虫病，但若缺乏特定的神经影像学表现很难诊断，Fei等[9]收集分析7例脑脊液，通过高通量测序技术检测出猪带绦虫，明确诊断了临床上缺失病原学证据的病例。

侵袭性真菌感染往往发生在免疫力低下的人群中，其确诊依靠活检，而侵入性活检对于免疫功能低下者感染风险更高。Hong等[10]使用无细胞血浆测序技术无创检测真菌感染患者的真菌DNA，该试验从血浆中识别出身体各个部位的霉菌，显示了无细胞血浆测序能够整合来自许多器官的信息。

1.2 较快的检测速度

根据使用试剂盒的不同，DNA文库的制备最短只需2.5小时[11]，高通量测序技术具有能够在短时间内获得病原体基因组的特点，在传染病检测中应用较广。传染病传变速度快，容易发生变化，高通量测序技术可以疾病初期从标本中快速获得病原体的全基因序列，准确快速地鉴定病原体性质，分析其亚型，对溯源和后续治疗都有很大的帮助。

茂海燕等[12]自2013年开始采用高通量测序技术，通过建立数据库、测序及数据处理流程，实现了在收到标本后3天左右快速获得甲型流感病毒序列和亚型鉴定的结果，为应对新型流感病毒突发疫情提供了技术。

2020年初SARS-COV-2病毒在全球范围内广泛流行，同年4月，Pillay等[13]在南非应用高通量测序技术，使用Nextera DNA flex试剂盒耗时不到3小时得到了该样本的所有DNA片段，且基因测序成功率高达90.9%，它能够为分析遗传变异和鉴定传播链提供快速准确的信息。该团队利用不到3周的时间对108个样本进行测序，完成了南非一次大规模COVID-19的数据生成和分析。Jary等[14]采集法国首例SARS-CoV-2感染患者的每日呼吸道样本，运用高通量测序技术观察病毒准种的改变，发现不同时间以及同一天不同解剖结构的病毒存在变异，说明SARS-CoV-2在体内表现为复杂而动态的变异分布。

1.3 精确预测耐药基因组

高通量测序技术的重要优势是不依赖微生物药敏实验而能精准预测微生物的抗生素耐药状况[15]。多项研究表明，与第一代测序相比，高通量测序技术不仅可以确认第一代测序验证的耐药位点，还有助于检测出抗生素耐药基因出现的新发突变，并且通过进一步的实验确定这些基因导致抗生素耐药模式的原因。已有研究比较了使用高通量测序技术和第一代测序方法检测耐药突变的区别，第一代测序法遗漏了至少一半由高通量测序技术鉴定出的耐药突变，而这些突变已经被证实与治疗失败的风险相关[16]。高通量测序技术通过对转座子、整合子和质粒的检测确定目前病原体耐药的模式，随着病原体耐药性的蔓延，运用新一代技术在减轻当前耐药状况以及预测新的耐药机制中刻不容缓[17]。

耐药结核是结核病防控工作中亟待解决的问题。虽然目前在结核分枝杆菌耐药研究方面已取得了较大的进展，发现了许多与耐药相关的基因及点突变，但许多耐药现象仍有待深入阐释。借助高通量测序技术和比较基因组学等方法大大提高了发现耐药基因和突变位点的效率。近期研究发现[18]，Rv3792基因的同义SNP突变可增加下游基因embC表达，从而引起对乙胺丁醇的耐药性增高，增加了对结核分枝杆菌耐药机制的认识。在研究南非地区近期暴发的耐药结核病传播中，Ioerger等[19]通过对全基因组的比较发现，当地广泛耐药结核菌是逐步获得耐药性而形成，并非直接广泛耐药结核进行传播。在中国，通过对2株广泛耐药结核菌全基因组分析后也得出相似结论，认为广泛耐药菌株产生的原因是单个药物耐药逐步累积的结果[20]。

耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Carbapenem resistant Klebsiella Pneumoniae，CRKP）作为耐碳青霉烯肠杆菌（Carbapene-resistant enterobacteriaceae，CRE）中的重要组成部分，已成为全球层面的主要公共问题之一，监测和有效控制感染对于限制CRE的传播至关重要。Giani等[21]发现，CRKP的传播流行是通过复制高风险碳青霉烯酶，例如产KPC型酶的ST258型菌株实现的。Fasciana等[22]通过高通量测序技术对25株耐碳青霉烯（CRKP）和25株易感性（Carbapenem susceptible Klebsiella Pneumoniae，CSKP）肺炎克雷伯菌菌株进行全基因组对比，发现CRKP中参与编码β内酰胺酶的基因中blaSHV、blaTEM、blaKPC、blaOXA 和 blaCTX-M 最频繁，证明肺炎克雷伯菌对碳青霉烯药物耐药机制跟上述基因相关。随着粘菌素的临床重复使用，出现了由染色体和质粒抗性机制介导的耐大肠菌素的肺炎克雷伯菌株，Hadjadj等[23]通过测序老挝和泰国5种相关菌株，除广泛报道的mcr-1基因外，首次发现mcr-3变体及mcr-8变体基因呈阳性且共现，说明在研究大肠菌素耐药机制时应监测mcr基因的传播和进化。

1.4 掌握病原体毒力

了解病原体的毒力能评估、预测疾病严重程度和转归，有助于选择更有针对性的抗感染治疗。产志贺毒素的大肠埃希菌O104:H4型曾引发过大规模疫情，然而其已知的进化历史和基因组多样性等相关信息较少。Zhou等[24]使用高通量测序技术进行暴发和非暴发菌株系统发育学分析，为其后续研究提供了进化背景，并揭示谱系特异性标记。一项回顾性研究[25]通过对肿瘤患者血液艰难梭菌感染引起的腹泻标本的高通量测序，能够得到跟毒力相关的基因，表明大多数感染是由于携带cdtAB的产毒菌株引起，虽然该基因的携带与死亡之间关系不明显，但依然对临床工作有参考价值。

白喉毒素（DT）是由人类病原体白喉棒状杆菌以及人畜共患的溃疡杆菌和假结核杆菌的产毒菌株产生的。产毒菌株可能导致严重的呼吸道白喉、心肌炎、神经系统损害或皮肤白喉。Alexandra等[26]通过对137种产毒或非产毒性棒状杆菌进行全基因组测序，分析其编码白喉毒素的tox基因和白喉毒素抑制基因dtxR，总结为4种具有物种特异性的分支，对应白喉杆菌、假结核杆菌、非典型溃疡杆菌和溃疡杆菌，从而识别出不同棒状杆菌的亚群。而与白喉杆菌中噬菌体不同，仅存在于溃疡杆菌中的致病岛也说明了不同人畜共患疾病的菌株之间的毒性传播途径可能有所不同，以至于可能使其产生新的致病潜力。

2 典型病例

患者，男，72岁，农民，因“反复干咳胸闷气急发热6月余”于2020年8月25日于浙江省中医院呼吸内科住院。患者既往有骨髓增生异常综合征病史，主要表现为粒系、红系增生低下，否认特殊职业史及接触史，否认吸烟史。查体：体温38℃，脉搏 106次/分，呼吸 25次/分，血压 106/69mmHg。双肺呼吸音粗糙，右下肺闻及湿啰音，未及哮鸣音，口唇粘膜苍白，余无明显异常。辅助检查：WBC 8.3×109/L，Hb 67g/L，PLT 183×109/L，CRP 64.7mg/L，PCT 0.254ng/mL，ESR 32mm/L。胸部 CT 示：两肺散在团片状及结节状高密度影。患者呼吸道病原检测、结核菌抗体实验未见明显异常。入院诊断:肺炎，骨髓异常增生综合征。

患者入院后予头孢唑肟抗感染、化痰平喘、升白细胞及输注红细胞等对症治疗，予莫西沙星等抗感染效果不佳，发热原因及肺部病灶病理性质不明，于2020年8月26日行纤维支气管镜检查，见两肺支气管黏膜苍白，管腔内分泌物较多，白呈泡沫状，于左下肺基底段行肺泡灌洗送检NGS及G、GM实验，X-pert，培养及真菌涂片检查。肺泡灌洗液G实验+内毒素：真菌（1-3）-β-D 葡聚糖 186.6pg/mL，革兰氏阴性菌脂多糖＞2.500EU/mL。X-pert培养及真菌涂片均未见异常。NGS结果提示卡式肺孢子菌感染。根据相关辅检结果予卡泊芬净50mg，静脉滴注，1次/d及复方磺胺甲恶唑片1.44g口服，1次/6h抗真菌感染，12天后复查胸部CT示：两肺散在团片状及结节状高密度影较前片（2020-08-24）部分吸收。出院2个月后续随访患者胸闷气急干咳症状较前好转。

肺孢子菌肺炎（Pneumocystis carinii pneumonia，PCP）与免疫功能低下的患者的发病率和死亡率显著相关，包括中性粒细胞减少症、异基因造血干细胞移植、实体器官移植、长期使用免疫抑制的患者，尤其是获得性免疫缺陷综合征患者[27]。PCP以发热、干咳、呼吸困难为主要症状表现，影像学表现为磨玻璃片浑浊，呈中心状分布，也可表现为结节，诊断依靠病原学。但由于标本采集不理想、染色及对镜检的技术要求高，很难培养出病原体。本例入院后即予纤维支气管镜检查，及时送检标本，行高通量测序，结果为G试验阳性，余均阴性，考虑存在真菌感染，而NGS则准确定性病原体类型为卡式肺孢子菌，临床根据NGS结果精准治疗，疗效确切。

3 亟待解决的问题

目前，高通量测序中测序平台众多，测序方法与技术不尽相同，故有不同的测序特点。当前使用较多的是由Illumina提供的测序平台，其缺点在于在同一过程中病原体会交叉污染其他样本，从而导致假阳性；太平洋生物科学的测序平台设备价格高昂，对样本要求高；牛津纳米孔技术虽提供了便携式测序仪，测序时间较其他测序平台短，但其测序错误高、通量低，“每次读取成本高”的特点限制了它的使用。测序平台的不同也导致了基因数据库构建的不同，参考数据库的不足可能导致假阴性。所以统一测序平台和完善参考数据库对于取得准确的结果至关重要。

在NGS的使用过程中，大多数样本中的微生物核酸受人体宿主背景的支配，虽然测序的微生物非人类读物相对较少，但依然影响测序结果的灵敏度。为了减少微生物的污染和结果的准确，NGS对样本的提取要求较高。但是临床样本的采集不能做到完全无菌无核酸，所以需使用阴性对照，进行试剂评估，并定期测试，以避免实验室和样品的交叉污染导致的假阳性结果。

4 总结

目前，高通量测序技术及基于高通量测序技术的临床宏基因组学概念已经应用于临床。从本文病例中可知，不明原因的发热伴呼吸道感染者早期应用NGS检测病原体，及时诊断，临床获益较大。对于机会致病性病原体，定植菌、稀有病原体的检测，临床可供选择的检查较少，且敏感性低、阴性结果不能完全排除感染可能。NGS能够快速、灵敏地检测病原体，提供致病菌的种属信息、病原体耐药证据、毒力情况，帮助临床医生选择合适的抗生素，阴性结果则能很大程度排除感染的可能。

近几年，关于高通量测序的临床报道层出不穷，但是几乎所有的病例报告都是回顾性或小样本研究，仍缺乏大规模的前瞻性研究来证实其临床一线使用的可靠性和经济、社会效益。同时，也存在着平台不一、样本处理的试剂耗材各异、参考数据库不同等问题。从长远来看，建立统一的病原体分型标准，构建全球共享的高通量测序技术参考数据库势在必行。因此亟需大规模多中心临床试验制定统一的质控标准及检测流程，从而实现感染性病原体的监测与管理，以及高通量测序技术数据的精准靶向抗生素治疗，推动个性化微生物学的发展[28]。