UPLC-MS-MS快速测定烟草中131种农药残留量

师君丽 孔光辉 逄涛 李勇 吴玉萍 宋春满

摘  要：采用QuEChERS-超高效液相色谱-串联质谱法建立了烟草中131种农药残留的同时测定方法，样品用1%乙酸-乙腈萃取，氯化钠和无水硫酸镁盐析，经PSA固相分散吸附剂净化，采用正负离子多反应监测（MRM）模式检测，外标法定量。结果表明，131种农药在1～200 μg/L范围内线性关系良好，决定系数（r2）均大于0.99，方法的检出限为0.05～24.50 μg/kg，131种目标物的平均回收率为65.3%～112.4%，RSD为3.2%～7.3%。该方法简便、快速、灵敏、可靠，适用于烟草中131种农药残留的快速测定。

关键词：QuEChERS;超高效液相色谱-串联质谱;烟草;农药;残留

Abstract： An analytical method for simultaneous determination of 131 pesticide residues in tobacco was established by QuEChERS-ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （ UPLC-MS/MS）. Tobacco samples were extracted with 1%（V/V） acetic acid-acetonitrile， salted out with sodium chloride and anhydrous magnesium sulfate， cleaned up with primary secondary amine PSA solide-phase dispersion， the extracts were then determined by UPLC-MS/MS in positive and negative ion modes and multiple reaction monitoring （MRM） mode， quantified by the external standard method. The results showed that all the 131 pescitides had good linearity in the ranges of 1-200 μg/L， with the coefficients of determination （r2） higher than 0.99. The limits of detection （LOD） were from 0.05 to 24.50 μg/kg. The average recoveries of all the pesticides were in the range of 65.3%-112.4% with the relative standard deviations between 3.2% to 7.3%. The method is simple， rapid， sensitive and reliable for determination of the 131 pesticide residues in tobacco.

Keywords： QuEChERS; ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS）; tobacco; pesticides; residues

化學农药是烟叶生产中防治病虫害的重要技术手段，对保证烟叶产量和提高烟叶品质有举足轻重的作用。目前农药残留问题日益凸显，严重影响烟叶和卷烟质量安全。为了控制农药残留，减少吸烟危害，国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）农用化学品顾问委员会（ACAC）于2003年提出了烟草中99种农药的最高指导性残留限量（GRLS），2019年将农药名单扩展至116种[1]，中国烟草总公司于2014年下发了YQ 50—2014《烟叶农药最大残留限量》，明确规定了烟叶中123种农药的最大残留限量（MRLS）[2]。

农药种类繁多，对其残留的分析已经由单一农药残留分析向多种农药残留分析发展。根据农药性质不同，目前用于农药多残留分析的方法主要有气相色谱-质谱法（GC-MS）[3-5]、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）[6-9]、液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）[10-16]，文献[13-17]采用UPLC-MS/MS法测定烟草中的多种农药残留，但覆盖《烟叶农药最大残留限量》名单中的农药种类较少（12～50种）;文献[18-20]利用LC-MS/MS法测定烟草中的多种农药残留（73～118种），检测种类更多，但分析时间较长（45～55 min）。

本研究采用优化后的QuEChERS前处理UPLC-MS/MS多反应监测（MRM）技术建立了烟草中131种农药残留的分析方法，采用分离效能更好、分析时间更短的UPLC，9 min即可完成烟草中131种农药残留的同时测定，相比以往的LC-MS/MS研究，扩充了检测指标，缩短了分析时间，为烟草中多种农药残留的快速检测提供了一种可靠的分析手段。

1  材料与方法

1.1  仪器与试剂

ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，美国Waters公司;AB Sciex 5500三重四极杆质谱仪，美国Sciex公司;Talboys数显型漩涡混合器，美国Troemner公司;高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司;Millipore Simplicity超纯水机，美国Millipore公司。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸、乙酸铵，色谱纯，美国Fisher公司。无水硫酸镁，分析纯，用前在650 ℃灼烧4 h，贮存于干燥器中备用。氯化钠、柠檬酸钠、柠檬酸氢二钠，分析纯。N-丙基乙二胺键合固相吸附剂（PSA吸附剂），美国Agilent公司。

2.4  质谱条件的优化

分别将131种农药标准储备液稀释至0.01 mg/L，采用仪器自带的蠕动泵以10 μL/min的流速注入离子源，分別在电喷雾正离子（ESI+）和负离子（ESI-）模式下进行母离子全扫描，确定各农药的分子离子峰和电离方式，2，4，5-涕、2，4-滴、菌核净和麦草威在负离子模式下响应值优于正离子扫描模式，其余农药在正离子模式扫描下响应值最大，灵敏度最高。进一步优化锥孔电压、离子源温度、气帘气压力、雾化气压力、辅助气压力等质谱参数，对母离子进行子离子扫描，找到二级碎片离子，通过MRM扫描模式优化解簇电压（DP）、碰撞能（CE）等参数，使131种化合物特征碎片离子的响应达到最大，优化出的最佳质谱参数见表1。

2.5  色谱条件优化

2.5.1  色谱柱的选择  T3柱和C18柱是农药检测常采用的色谱柱。本实验比较了Waters公司生产的 ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC BEH C18（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）、ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）4种色谱柱对131种目标农药的出峰效果。C18柱对于甲胺磷、久效磷、氧乐果、苯线磷亚砜、特丁硫磷亚砜和噁唑菌酮这些农药峰形不如T3柱，两者比较，T3柱的峰形更好，出峰时间比C18柱更早，150 mm柱的分离度比100 mm的更好，综合考虑，最终选择ACQUITY UPLC HSS T3（150 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱作为本研究的分离柱。

2.5.2  流动相体系的选择  流动相的组成不仅会影响目标农药的峰形和保留时间，还会影响到离子化效率，从而影响灵敏度。实验考察了乙腈-水、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液（V/V）、5 mmol/L乙酸铵乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液3种流动相体系对目标农药在分离度、峰形、灵敏度方面的影响。结果显示，乙腈-水为流动相体系时，大部分农药峰型较好，但霜霉威、甲氨基阿维菌素苯甲酸盐峰型较差;加入乙酸铵对峰形改善不大，而且对部分农药的响应会有抑制;加入甲酸不仅可以增强正离子模式下目标农药的响应，提高灵敏度，还可以改善峰形，特别是对霜霉威和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐峰形改善较大，氧乐果、咪鲜胺、仲丁灵和二甲戊灵也获得更好的峰型;三者相比较，引入甲酸的体系分离效果更好，因而选用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液（V/V）体系作为流动相。

2.5.3  流动相梯度的优化  流动相的配比对农药保留时间、峰型和分离度都有较大影响。对于复杂样品中的多种农药组分分离，一般采用梯度洗脱，首先选择高比例水相开始，保持一定时间后逐步提高有机相比例，使目标农药保留时间延后，干扰物和目标物得到较好分离，有效降低基质效应。本文优化了流动相初始比例、不同梯度的流动相比例、梯度持续的时间及梯度变化时间，考察了不同流动相梯度洗脱参数下131种农药的出峰效果，发现丁硫克百威、烯虫酯峰型受流动相梯度变化影响非常大，较难获得好的色谱峰。当采用1.4节的梯度洗脱程序时，上述两种农药获得较好峰型，杂质与目标物分离较好，且所有农药峰型尖锐对称，响应明显提高，131种农药的总离子流色谱图见图1。

2.6  基质效应的考察

基质效应（ME）对检测结果准确性的影响不容忽视。减少基质效应的措施有[21-24]：合适的样品前处理方法，采用合适的色谱分离条件，采用同位素或性质相似的物质作内标校正，配制基质匹配标准曲线，稀释，等。采用被测物的同位素作内标校正准确性最高，但因同位素标记物的种类少，而且价格昂贵，在多残留分析中应用不多;且农药性质差异较大，如果内标物选取不合适，将会影响检测结果的准确性。本文在优化前处理方法，优化色谱分离条件，基质稀释5倍等措施基础上，通过目标农药在纯溶剂中的平均响应值（A，n=3）和基质匹配标准溶液的平均响应值（B，n=3），得到相对基质效应ME=B/A×100%[25]，当ME大于100%表示存在基质增强效应，小于100%表示存在基质抑制效应。本试验考察了131种农药在10 μg/L水平的相对基质效应，94种产生基质抑制效应，37种产生增强效应，其中，蚜灭磷、吡蚜酮、甲基嘧啶磷、吡虫啉等39种化合物的ME超过（100±20）%，基质效应较明显，只有苯霜灵、三唑醇、硫双威等20种化合物的ME在（100±5）%以内，因此，采用基质匹配标准溶液进行校准来消除基质效应是可行的。文献[17]报道多菌灵、吡虫啉表现出较强的基质抑制效应，与本研究结果相符，文献[18]报道涕灭威和苯霜灵受基质影响不大，本试验结果表明苯霜灵受基质影响不大，但是涕灭威受基质影响较大，可能是采用的基质效应评判方法不同，结果也不尽相同。

2.7  方法的检出限、定量限和回收率

将基质匹配标准溶液进样检测，并绘制标准曲线，以3倍信噪比确定检出限（LOD），结果见表1，各农药均具有较好的线性关系，决定系数（r2）均大于0.99。选择空白烟草样品，进行回收率和精密度考察，在10、50、100 μg/kg三个添加水平下进行加标回收试验，每个加标水平重复测定5次，由表1可见，131种目标物的平均回收率为65.3%～112.4%，RSD为3.2%～7.3%，检出限为0.05～24.50 μg/kg。

2.8  方法的应用

利用本法对CORESTA国际共同试验组织方FAPAS提供的烟草样品进行农药残留测试，spiked烟样共检出13种农药，结果见表2，数据偏差与标准偏差的比值（Z值）在±2以内为良好结果的有12种，Z值小于±0.5的有8种，与参考值非常接近，说明了本方法的适用性和有效性。

3  结  论

采用QuEChERS—UPLC-MS/MS法同时测定烟草中131种农药残留，优化了提取净化方法、色谱条件和质谱条件，同时考察了基质效应。最终采用1%乙酸-乙腈提取，PSA固相分散吸附剂净化，正、负离子多反应监测（MRM）模式检测，基质匹配外标法定量，9 min即可完成131种农药的残留检测，131种农药在烟草中3个加标水平下的平均回收率为65.3%～112.4%，RSD为3.2%～7.3%，检出限为0.05～24.50 μg/kg。该方法简便快速、灵敏准确，极大的提高了实验室的检测速度和检测通量。

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