模拟失重对成年小鼠闪光视网膜电图和视网膜微循环的影响

戴旭锋,保金华,陈晓萍,李文炯,黄海笑,陈 浩

0 引言

失重状态下液体悬浮无沉降，航天员体内的流体静压消失，血液和其他体液不像重力条件下那样惯常地流向下身。相反，约有2000mL血液由下身转移到胸腔和头部，其中20%左右重分布到头面部，可引起宇航员面部浮肿、头胀、颈部静脉曲张和鼻咽部堵塞等改变[1-3]。血液重新分布后，头部灌流压增高20～30mmHg[4-6]。近年来国外航天医学研究发现，航天员在太空失重环境下，出现了不同程度的视觉功能和解剖学的改变，包括视盘水肿、眼球变扁、视网膜皱褶、远视以及眼内压升高等；这些改变有的人是短暂的，有些人要持续较长的时间。初步研究结果提示，可能与航天员头部(尤其是眼球)血液重新分布有关[2-3,7]。至于失重对眼球尤其是视网膜的影响有多大，能否恢复，是否会造成视网膜永久性损害等，这些问题目前尚不清楚。文献报道一些啮齿类动物在地面，通过改变体位的方式，可以模拟失重状态下体液重分布[8-9]，本研究选择小鼠进行实验。在观察指标方面，闪光视网膜电图(electroretinogram,ERG)能客观反映视网膜整体功能，其中振荡电位(oscillatory potentials,OPs)还能敏感地反映视网膜中内层的血液循环状态[10-11]。本研究通过以上功能学检测，并结合一些相关的形态学研究，来初步探讨模拟失重对小鼠视网膜的影响。

1 材料和方法

1.1材料健康雄性2月龄清洁级C57BL/6J小鼠36只，体质量23±3g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(苏)2016-0003。小鼠饲养于12h明/12h暗交替环境中，实验动物饲养及操作，均在温州医科大学眼视光学院动物实验中心进行。小鼠的喂养和使用，符合浙江省实验动物管理的有关规定和条例。10%荧光素钠注射液购自美国爱尔康公司；小鼠源抗Rhodopsin抗体(一抗)购自美国Millipore公司，兔源抗红/绿视锥细胞视蛋白(Opsin)抗体(一抗)、兔源抗蓝视锥细胞Opsin抗体(一抗)和Cy3标记的山羊抗兔IgG(二抗)均购自德国Merck Millipore公司，Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG(二抗)购自美国Thermo Fisher Scientific公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自美国Roche公司。

1.2方法

1.2.1动物模型的制备和分组按随机原则，将动物分为3个实验组和3个相应的对照组，最终每组6只小鼠。实验组参照Morey-Holton大鼠尾部悬吊法[8]，稍加改进，使之更适合建立小鼠模拟失重模型。实验动物单笼饲养，尾部悬吊于笼顶，后肢自然悬空不受力，躯干长轴与笼底水平约呈30°角。前肢可正常抓地，小鼠能在笼底一定范围自由活动，但始终保持头低位，造成腹部和后肢的体液头向重分布。期间，动物能顺利进食和饮水。对照组小鼠也单笼饲养，尾部装置同实验组，但躯干长轴与笼底水平可呈0°角。对照组小鼠的摄食量，与相应的实验组前1d的摄入量相同。具体分组如下：实验1组(尾悬15d)，实验2组(尾悬30d)，实验3组(悬吊30d后恢复体位30d)；对照1组(正常饲养15d)，对照2组(正常饲养30d)，对照3组(正常饲养60d)。作为对照的3组小鼠不改变正常体位，分别饲养15、30和60d，然后同样进行视网膜检测。

1.2.2 ERG小鼠暗适应过夜后，用复方托吡卡胺眼药水充分散瞳。氯胺酮(72mg/kg)和赛拉嗪(4mg/kg)混合液腹腔注射，动物全身麻醉后在角膜缘放置环状细金丝电极，作为记录电极；双耳正中头皮下插入的针状电极作为参考电极，尾根部皮下插入的针状电极作为地电极。全视野球形刺激器(Ganzfeld Q450)，标准白色闪光强度为3.0(cd·s)/m2，诱导暗适应ERG。记录混合反应时，通频带设为0.2～500Hz；记录OPs时，通频带设为65～300Hz[12]，单次闪光刺激持续时间为2ms，对相关反应波的幅值进行测量并分析。

1.2.3荧光素眼底血管造影应用小动物视网膜影像系统(Micron IV)，对小鼠行荧光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography,FFA)检查。小鼠全身麻醉后置于专用的小动物台上，使用人工泪液防止角膜干燥及屈光间质混浊，被检眼充分散瞳。调整小鼠眼位，镜头向角膜缓慢推进，不断调焦直至眼底清晰可见，且视乳头基本居中。然后，动物腹腔注射荧光素钠(0.001mL/g)。蓝光照射下，循环至眼底血管的荧光素被激发出黄绿色荧光，对视网膜微血管的循环情况进行拍照[13]。

1.2.4免疫组化检测感光细胞视色素或视蛋白的表达取材、固定和脱水：小鼠处死后马上取眼球，在1×PBS中快速剪除角膜，将眼球即刻浸泡在4%多聚甲醛溶液中固定过夜(pH=7.4，4℃)，固定好的眼球在30%蔗糖中脱水4h。冰冻切片制备：眼球标本在包埋剂中浸2h，-80℃包埋然后冰冻切片，片厚12μm，切片方向与视轴平行。贴片于载玻片，在室温下干燥30min。免疫荧光染色：冰冻切片置于穿透液(0.3% Triton X-100)中30min，增强细胞膜的通透性。常温下，在5%牛血清白蛋白(工作液)中封闭1h。滴加一抗孵育过夜(4℃)，常温下二抗孵育2h(避光)。用到的一抗有小鼠源抗Rhodopsin抗体(1∶300)、兔源抗两种视锥细胞Opsin抗体(1∶400)，合适的二抗有山羊抗小鼠IgG(1∶400)和山羊抗兔IgG-Cy3(1∶1000)。1×PBS清洗，滴加DAPI染细胞核，免疫荧光显微镜(Zeiss)检查。

1.2.5视网膜组织细胞凋亡检测TUNEL(TdT-mediated dUTP nick end labeling)细胞凋亡试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况[14]。小鼠视网膜冰冻切片在0.2%的Triton X-100中处理，然后浸洗干净。将50μL的TdT和450μL荧光素标记的dUTP液混匀，制备成TUNEL反应混合液。TUNEL技术常常造成假阴性或假阳性，因此有阳性对照和阴性对照可更准确地对结果进行分析。阳性对照先加100μL的DNaseⅠ液，反应控制在15℃～25℃，持续时间为10min，然后再加50μL的反应混合液；阴性对照仅加50μL荧光素标记的dUTP液。本实验悬吊组和相应的对照组视网膜标本，直接加50μL的反应混合液；切片在暗湿盒中反应1h(37℃)，漂洗干净后盖上盖玻片，在荧光显微镜(激发光的波长为488nm)下观察。

图1 模拟失重组和对照组小鼠暗适应闪光ERG A：混合反应;B：OPs。

图2 模拟失重组和对照组小鼠FFA图 荧光素注射后5min进行拍照，在距离视乳头3PD的区域，比较各组视网膜的微循环状态。实验1组视网膜微血管网，较其他组更加密集，呈迂曲、扩张的表现。A：对照1组；B：实验1组；C：实验2组；D：实验3组。

表1 模拟失重组和对照组小鼠暗适应闪光ERG的b波和O2波幅值比较

统计学分析：采用统计学软件SPSS17.0分析数据，所有定量资料均满足正态分布，以均数±标准差表示。悬吊组与相应天数的对照组之间，数据比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1模拟失重对小鼠ERG的影响闪光ERG的混合反应和OPs，都是在3.0(cd·s)/m2的强光刺激下，由视网膜产生的生物电信号。混合反应b波幅值，实验1组较对照1组升高，且差异有统计学意义(t=2.860,P<0.05，图1A，表1)。实验2、3组的b波幅值，与对照2、3组相比，差异均无统计学意义(t=1.350、-0.487,均P>0.05，表1)。同混合反应不同，OPs是在较窄通频带(本实验设为65～300Hz)条件下记录到的一组节律性小波，后者不受b波影响。小鼠OPs一般含有3～6个子波，各子波间隔时间约为10ms，其中第二子波(O2)相对比较稳定。实验1组O2幅值为197±33μV，对照1组O2的幅值为336±47μV，两者差异有统计学意义(t=-5.938,P<0.001，图1B，表1)。实验2、3组的O2幅值，与对照2、3组比较，差异均无统计学意义(t=-1.887、1.023,均P>0.05，表1)。

2.2模拟失重对小鼠视网膜血液循环的影响10%荧光素钠在1s内被快速注射完毕，然后开始计时。注射后3～5s，视乳头及视网膜动脉开始显影，然后各级血管相继快速充盈；至5min时，视网膜毛细血管已充盈；5min后脉络膜的背景荧光开始逐渐变亮。在荧光素注射后5min时，对距离视乳头相同距离的后极部视网膜，进行观察并比较微循环状态。结果显示，实验1组视网膜微血管网较其他组更加密集，呈迂曲扩张的表现，而视网膜大血管管径、走行未见明显异常(图2B)。实验2、3组，微循环均未显示明显异常，与相应的对照组没有区别(图2C、D)。

2.3各组感光细胞视色素或视蛋白的表达以及TUNEL染色情况模拟失重的实验组中，感光细胞视色素或视蛋白的表达未见明显异常(图3)。在此基础上，我们还进行TUNEL细胞凋亡检测，观察模拟失重是否造成视网膜中内层神经细胞的损伤。根据特殊的荧光素标记，TUNEL试剂盒能准确地定位正在凋亡的组织细胞。本实验结果显示，模拟失重的3个悬吊组小鼠，视网膜各层组织细胞均未见明显的凋亡(图4)，与相应的对照组没有区别。

3 讨论

太空失重状态与人类生存的地球环境完全不同，失重对已适应地球重力作用的哺乳动物的影响，已成为空间生命科学研究的热点之一。国际公认的在地面模拟失重效应(体液头向重分布)的方法，包括适用于人[15]和猕猴的头低位卧床实验[16]，以及适用于小型啮齿类动物的尾悬吊实验[9]。以小鼠为例，体位改变后身体躯干与水平面的夹角越大，腹部和后肢体液发生头向转移的量越多。但夹角过大时，正常的进食进水会受到严重影响，将导致动物体质量锐减，存活期普遍很短(≤1wk)，造模反而不能成功。

图3 模拟失重组和对照组小鼠视网膜感光细胞视色素或视蛋白的表达(免疫荧光染色×200)视杆细胞感光色素(Rhodopsin)染成绿色，视锥细胞视蛋白(Opsin)染成红色，细胞核染成蓝色。A：对照1组；B：实验1组；C：实验2组；D：实验3组。

图4 模拟失重组和对照组小鼠视网膜组织细胞凋亡检测(TUNEL染色×200)凋亡细胞中断裂DNA会结合特异性的基团，并产生显色反应。A：阳性对照；B：对照1组；C：实验1组；D：实验2组；E：实验3组。ONL：外核层；INL：内核层；GCL：神经节细胞层。

当身体躯干与水平面的夹角减至30°时[9]，动物正常的进食和饮水量基本不受影响，除造模容易成功外，实验的干扰因素也最少。

哺乳动物的外层视网膜组织，基本上都含有两种感光细胞，分别为视杆和视锥细胞。视杆细胞感光色素(Rhodopsin)和视锥细胞特异性Opsin的表达情况，与视网膜的生理功能和ERG结果密切相关。闪光ERG能够客观、敏感地反映全视网膜的整体功能。ERG混合反应的b波上升支，通常有一组规律的振荡小波(OPs)，后者被认为起源于视网膜中内层神经网络的抑制性反馈回路[10-11]。我们以小鼠作为研究对象，动物改变体位后短期内OPs幅值下降。OPs幅值的变化同b波不一致，提示前者可能是模拟失重状态下，体液重新分布所导致的特异性改变。从ERG混合反应以及感光细胞视色素或视蛋白的表达情况来分析，视网膜外层的神经细胞(光感受器)并未受到较大的影响。模拟失重状态下体液重新分布，可能主要影响视网膜中内层的功能。本研究发现，视网膜OPs的变化规律，可以用来验证动物造模是否成功。

根据本研究中几个时间点的ERG数据，我们发现视网膜功能变化呈如下趋势：(1)模拟失重短期内(尾悬15d)，视网膜中内层呈现功能下降，小鼠OPs幅值约为正常水平的60%。(2)模拟失重时间延长(尾悬30d)，可能随着动物自身调节机制的启动，视网膜相关功能又出现回升，此时OPs幅值达到正常水平的85%左右。(3)尾悬30d小鼠恢复正常体位1mo后，视网膜中内层功能基本上能完全恢复至正常水平。除了小鼠之外，人体在地面模拟失重的实验，也发现OPs在一定范围内发生波动[17]。

临床上发现，OPs对视网膜中内层的血液循环状态比较敏感。比如糖尿病视网膜病变和视网膜静脉阻塞的早期，由于视网膜循环发生阻滞和静脉淤血，OPs幅值可显著降低[10-11]。本研究中小鼠尾悬15d发生OPs异常，进一步行FFA检测，也发现该时间点视网膜微血管网呈迂曲、扩张的特点。以上可能与小鼠腹部及后肢的血液大量回流到头部，导致暂时的视网膜微循环异常有关。人体头低足高位卧床，模拟失重状态下血液重新分配，短期内也会造成头面部供血增加，同时引起眼部血液循环改变，这种改变对视功能可能造成影响[7]。

小鼠尾悬30d组，动物机体可能已经对模拟失重(体液头向重分布)状态产生适应，此时视网膜微循环和神经生物电反应出现恢复。人体模拟失重早期，视网膜在表现为功能的下降后；随着自身调节机制的启动，视网膜功能也会出现反应性升高，甚至超出正常水平；随着不断地自身调节，最终也能恢复到正常水平[17]。小鼠模拟失重短期内，形态学上除了视网膜微循环发生暂时性改变外，TUNEL染色未见视网膜组织细胞的结构性损伤。

从航天员经历过的短、中期在轨飞行情况来看[7]，失重对眼球的影响并不大且基本上能完全恢复。这与本研究中，动物实验的一些形态和功能检查结果基本一致。随着悬吊时间延长，视网膜微循环的异常状态发生改善，提示动物机体可能存在某种神经血管的调节机制。然而航天员长期在太空工作和生活后，视网膜及其功能出现紊乱，除了失重状态下全身体液重分布外，可能也和其他因素有关，如宇宙辐射，航天器内空气组成和湿度异常，特殊航空食谱，以及航天员生物节律异常等[18-19]。

小鼠尾悬短期内ERG-OPs异常，可能与视网膜中内层的微循环状态改变有关。相关的视觉电生理检测，不仅可以用来验证动物体液头向重分布的造模是否成功外；将来还可能适用于失重状态下，对宇航员的视网膜功能进行无创性监测。