一株仔猪腹泻大肠杆菌的分离鉴定与药敏试验

张辉，严关所，王韶琴，吕念词，张以芳

(1.泸西县白水镇农业综合服务中心，云南 泸西 652404; 2.云南农业大学动物医学院，云南 昆明 650201)

猪大肠杆菌病主要引起仔猪黄痢、白痢和水肿病，仔猪腹泻是养猪生产上比较常见的一种疾病，且在养殖过程中难以根治，会导致仔猪的生长发育受阻且死亡率高，严重影响了养猪业的发展[1]。大肠杆菌的种类不同，感染仔猪的年龄不同，临床症状也会不一样。仔猪黄痢主要发生在一周龄左右的仔猪，主要表现为排黄色浆状稀便，剖检时尸体严重脱水，肠道内有黄色液体状内容物[2]。而仔猪白痢则主要发生于10～30日龄的仔猪，会突然腹泻，排浆状或糊状粪便，颜色为乳白色或灰白色，有腥臭味[3]。

大肠杆菌是革兰氏阴性无芽孢的直杆菌，在MAC平板上生长时多数呈现红色或粉红色、表面光滑的菌落；在EMB平板上生长呈带有金属光泽的菌落，多为绿色或褐色，是区别其他杆菌的标志性现象[4]。生化反应活泼是作为大肠杆菌检测的重要生物学手段，MR试验和VP试验呈阳性，不和枸橼酸盐反应，不产生尿酸酶等特征[5]。大肠杆菌广泛分布于自然界，很多大肠杆菌都能够引起仔猪的腹泻，主要是产肠毒素性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、肠黏附性大肠杆菌等[6]，一些菌株在血平板上还有溶血现象。尽管大肠杆菌抗原主要有O、K、H和F四种，然而与腹泻有关的O抗原有170多种，K抗原有100种左右，H抗原有50多种[5]，不同地区、季节或不同年龄之间，流行的大肠杆菌血清型也不相同，大肠杆菌繁多复杂的血清型也增加了对其诊断防治的难度[7]。

一直以来，仔猪腹泻的发病率有明显上升的趋势，本实验从某猪场疑似大肠杆菌腹泻的仔猪身上采取样品，对其分离菌进行表型及16S rDNA鉴定、动物致病性试验及药敏试验，为其防治提供了科学依据。

1 材料与方法

1.1 病料来源

红河州某规模化猪场仔猪有突然腹泻、消瘦且同窝相继发病的现象，采取粪便及肛门拭子6份。

1.2 主要试剂

培养基(HE、MAC、营养肉汤、EMB)、单盒微量生化鉴定管、革兰染色剂、药敏纸片。2×Taq Super Mix、DL5000 DNA Marker、双蒸水。16S rDNA引物序列如下：16S-F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；16S-R：GGTTACCTTGTTACGACTT。

1.3 细菌的分离培养及镜检

首先对样品进行恒温振荡扩菌，然后分别划线于HE、MAC、EMB等培养基上37℃恒温培养18～24h，观察菌落特点，挑取单个菌落进行革兰染色镜检；挑疑似大肠杆菌的菌落于普通肉汤中过夜培养，所得菌液分别在MAC和EMB上二次划线并按照上述方法培养，染色镜检；再挑取单个菌落至普通肉汤中进行12h过夜，然后接种在加了血液的琼脂上培养。

将适量无菌生理盐水及大肠杆菌菌落制成细菌悬液，然后接种在各微量生化鉴定管，然后将生化管放在37℃培养箱中恒温培养24～96h，观察生化试验结果。

1.4 菌株的PCR、测序及分子鉴定

菌液进行16S rDNA扩增，本实验采用25μL体系：2×Easy Taq Super Mix 12.5μL，16S-F、16S-R各1μL，提取的DNA 1μL，ddH2O 9.5μL；瞬时离心后采用以下程序进行PCR扩增：94℃ 5min、94℃ 30s、54.5℃ 30s、72℃ 1min45s，35个循环，再72℃延伸5min。反应结束后1%的琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样品胶回收送擎科生物公司测序，测序结果在Genbank进行Blast对比。

1.5 致病性试验

挑取分离菌落于适量高压灭菌生理盐水中，制成细菌悬液，将小鼠分为试验组和对照组，各腹腔注射300μL的细菌悬液和灭菌生理盐水。分开饲养，观察小白鼠的发病及死亡情况。

1.6 药敏试验

取100μL经纯培养的菌液，用L玻璃棒将菌液均匀涂在琼脂培养基上，贴上药敏纸片，37℃培养18～24h，测量抑菌圈的直径。抑菌圈 15.1mm≤直径≤20.1mm为高敏、10.1mm≤直径<15.1mm为中敏、直径<10.1mm为耐药。

2 结果与分析

分离细菌经培养特性、染色特性、生化试验、16Sr DNA扩增及测序，确诊为大肠杆菌。

2.1 分离鉴定及表型鉴定结果

经过37℃恒温培养24h后，可以看见在普通琼脂上形成圆形菌落；在EMB平板上形成有绿色金属光泽的紫黑色菌落；在血琼脂上没有溶血现象；在麦康凯上形成圆形粉红色菌落，可见表面光滑、扁平、凸起，经过连续传代后菌落大小均一样。见图1。

图1 在麦康凯培养基上的分离培养

从MAC上挑取菌落进行革兰氏染色，镜检可观察到粉红色、两端钝圆、大小均一的革兰氏阴性短杆菌。见图2。

图2 染色镜检结果

分离菌生化培养鉴定，可使葡萄糖、甘露醇等产酸产气，乳糖、山梨醇、麦芽糖、MR试剂、VP试剂及蛋白胨水试验阳性，尿素酶、Kotser氏枸橼酸盐肉汤、卫矛醇试验阴性，符合大肠杆菌的生化特性。

2.2 分离菌PCR、测序及分子鉴定结果

取分离菌株纯培养菌液，用16S rDNA引物PCR扩增, 都能扩增出1500bp大小的特异性目的条带。见图3。

M：DL5000 DNA Marker ；N：阴性对照；1-2：样品

测序结果通过Blast对比，结果与大肠杆菌的同源性达99.69%，表明分离菌属于大肠杆菌。

2.3 致病性试验结果

分离菌株接种小白鼠，24h后小白鼠精神不佳，食欲减少，48h后有腹泻、呼吸减弱的现象。将小白鼠剖检，在MAC上接种其组织液培养24h，有粉红色菌落长出，染色镜检与分离菌的形态一致，表明使小白鼠出现腹泻的就是大肠杆菌。

2.4 药敏试验结果

分离菌对头孢唑啉、头孢呋辛、头孢他啶、头孢曲松、头孢哌酮、丁胺卡那霉素、呋喃唑酮(痢特灵)等7种药高敏；哌拉西林、头孢氨苄、新霉素、米诺环素、红霉素、氧氟沙星、多粘菌素、氯霉素等8种药中敏；青霉素、苯唑西林、羧苄西林、头孢拉定、卡那霉素、多西环素、麦迪霉素、诺氟沙星、环丙沙星、万古霉素、复方新诺明、克林霉素等12种药具有耐药性。

3 讨论

大肠杆菌病在不同养殖业上有不同的发病率及病死率，如2016年在黑龙江地区的平均发病率高达40%[8]。大肠杆菌病多用抗生素防治，但随着抗生素用量的加大，菌株的耐药性也就随着产生，薛原等也对哈尔滨地区猪场大肠杆菌的耐药性进行检测，结果80株大肠杆菌对多西环素等均有耐药性[9]。钟雯等对吉林地区猪源大肠杆菌分离株进行药物敏感性检测，结果表明分离菌株对氨苄西林、磺胺类药物中度敏感，对庆大霉素、头孢拉定耐药[10]。本实验分离培养到的大肠杆菌对呋喃唑酮、头孢曲松等药物高度敏感，对头孢氨苄、多粘菌素等中度敏感，对青霉素、复方新诺明等耐药,与文献报道的其他地区的结果有一定的差异，差异的存在可能与不同地区或猪场使用不同抗生素有关。

大肠杆菌病多为继发感染，或由于养殖环境恶劣而造成。因此，养猪场应该做好环境卫生、消毒管理和通风换气等措施，尤其是仔猪，在断奶前后应适当限制饲料量，适时补铁，增加仔猪本身的抗病力，防止饲料单一和蛋白质过高。另外，对猪场内水源进行定期检测，防止大肠杆菌超标，做好生物安全对大肠杆菌的防控很重要。