一种双层智能膜的制备及在指示三文鱼新鲜度中的应用

邹小波，薛 瑾，黄晓玮，翟晓东，张俊俊，张泽翔，甘子玉

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

随着对高品质、安全和新鲜食品的需求不断增加，消费者对食品包装也提出了更高的要求。包装不仅应该具有保护食品、方便运输的作用，还应该能反馈食品品质变化信息，因此食品新鲜度的智能指示包装是目前研究热点[1]。研究人员通过加入比色指示剂，如溴甲酚蓝[2]、甲基红[3]、聚苯胺[4]，根据与食品变质产生的挥发性成分发生反应而产生颜色变化来监测食品的新鲜度，然而这些化学色素价格较贵，且用于食品包装具有一定的毒性。花青素广泛存在于植物的花朵和果实中，易获得、价格便宜[5]、安全无毒害，是一种理想的食品变质监测指示剂[6]；但花青素性质不稳定，易受温度、光照、氧气、金属离子等因素的影响，在作为食品包装材料时氧气是影响其性质的最主要因素。因此本实验针对隔绝氧气进行研究，以提高花青素作为新鲜度指示型智能包装材料的稳定性[7-9]。

低酰基结冷胶是一种高分子线性阴离子多糖，由4 个单糖分子组成的基本单元重复聚合而成，作为乳化剂和稳定剂被广泛应用于饮料系统中[10]。Xu Xuejiao等[10]研究表明低酰基结冷胶可以通过与花青素的氢键作用力提高花青素稳定性。

聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）是生物相容性好、力学性能优良的合成高分子材料，在90 ℃下溶于水且透明无毒，具有良好的氧气阻隔性[11]。壳聚糖是一种无毒的阳离子多糖，具有良好的成膜性、抗菌性、阻氧性以及生物相容性，是优良的可降解包装材料[12]。祝二斌等[13]的研究表明壳聚糖和PVA存在的强烈氢键相互作用力，使得壳聚糖的热稳定性提高、PVA的结晶性下降。Naveen等[14]研究表明壳聚糖和PVA之间的强烈相互作用，使得其组合物之间可以完全混匀。刘文霞等[15]研究表明壳聚糖/PVA共混膜具有良好的成膜性能、力学性能和阻氧性能。

本研究以桑葚花青素为指示剂，结冷胶和花青素形成指示内层膜，壳聚糖和PVA结合形成外层膜，使用逐层组装技术制备双层指示膜，用于三文鱼的新鲜度指示。与单层膜相比，双层膜具有更好的机械性能，较低的水蒸气透过系数，可以通过隔绝氧气降低花青素氧化作用，提高其稳定性，目前鲜有类似的研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

桑葚干、新鲜三文鱼，均购自当地超市。

低酰基结冷胶、PVA、丙三醇、壳聚糖、硫代巴比妥酸 国药集团有限公司。

1.2 仪器与设备

高速粉碎机 江苏益勇仪器设备有限公司；食品物性仪 英国Stable Micro Systems公司；VIS-7220N可见分光光度仪 北京瑞利分析仪器有限公司；Nicolet iS50 傅里叶变换红外光谱仪（Fourier transform infrared spectrometer，FT-IR）仪 美国赛默飞世尔科技有限公司；Color Quest XE 色差仪 美国Hunter Lab仪器公司；pH计 意大利HANNA仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素提取

将桑葚干用粉碎机高速打磨成粉，过40 目筛备用，得到的粉末在60 ℃条件下，用体积分数75%乙醇溶液作为提取剂，按照料液比1∶10（m/V）混合，水浴锅提取3 h[16]。使用布氏漏斗对得到的提取液进行抽滤，得到花青素浓缩液。最后将花青素浓缩液进行冷冻干燥得到桑葚花青素粉[17]。

1.3.2 桑葚花青素在不同pH值下可见光谱的测定

利用紫外-可见分光光度计测定桑葚花青素在pH 2～12范围内的可见光谱，扫描波长为400～800 nm[18]。

1.3.3 壳聚糖/PVA-结冷胶花青素双层膜的制备

外层膜：取壳聚糖1.5 g溶解在体积分数为1%的乙酸溶液中以制备质量分数1.5%的壳聚糖溶液，将1.5 g PVA溶解在蒸馏水中并在85 ℃的水浴中搅拌4 h制备质量分数1.5%的PVA溶液。当PVA溶液冷却至室温时，将壳聚糖和PVA溶液按体积比1∶1混合，溶液超声去泡后备用。

图1 双层膜制备示意图Fig. 1 Schematic diagram for developing bilayer films

内层膜：取1.5 g结冷胶溶解在蒸馏水中以制备质量分数为1.5%的结冷胶溶液，将5 mmol/L氯化钙和体积分数为1.0%甘油加入结冷胶溶液中增强膜的性质，再加入基质干质量11.3%的桑葚冻干粉（桑葚冻干粉含量为4.29 mg/g）；双层膜（图1）：将结冷胶溶液超声去泡后倒入直径为9 cm的培养皿中，并在30 ℃烘箱中干燥24 h以形成内层膜，随后，将壳聚糖/PVA溶液倒入内层膜培养皿中，在30 ℃烘箱中干燥24 h形成双层膜。

1.3.4 内层膜组分优化设计

在单因素试验基础上对内层膜进行正交试验设计，选择结冷胶含量、氯化钙浓度、甘油含量3 个影响因子，按照L9（34）正交设计进行试验，各因素及其水平设计如表1所示，每组试验重复3 次。

表1 L9（34）正交试验因素水平Table 1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.3.5 指示膜厚度及机械性能的测定

用数显千分尺随机量取膜6 个点的厚度值，得到平均膜厚度，单位μm。

参照GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的测定》[19]的方法测定机械性能，把膜裁为60 mm×20 mm的长条状，采用质构分析仪的TA96装置测量膜的拉伸强度（tensile strength，TS）和断裂伸长率（elongation at break，EB）。初始夹距为40 mm，拉伸速率为0.6 mm/s，每组膜重复测定3 次。按照公式（1）和（2）分别计算TS和EB。

式中：F为试样断裂时承受的最大拉力/N；w为膜的宽度/mm；d为膜的厚度/mm。

式中：L1为膜断裂时的拉伸长度/mm；L0为初始夹距/mm。

1.3.6 指示膜的含水率以及透气性能测定

称取质量为m1/g的膜放置于温度设置为105 ℃的鼓风干燥箱中，烘干至质量恒定后，取出称得质量为m2/g，每组膜取3 个平行样品，按照公式（3）计算含水率[20]。

取20 mL蒸馏水倒入50 mL烧杯中，用膜包覆杯口并用细皮筋进行固定，在22 ℃条件下，放入含有硅胶的干燥器中。每隔2 h称量，称取6 次，每组膜取3 个平行样品，按照公式（4）计算水蒸气透过系数（water vapor permeability，WVP）[21]。

式中：x为膜厚/mm；S为有效面积，S＝18.08×10-4m2；Δm为水分透过的质量/g；t为间隔时间/s；ΔP为膜两边的压强差，ΔP＝3 179 Pa（22 ℃）。

1.3.7 指示膜的颜色稳定性测定

将膜裁为20 mm×20 mm的方形，分别置于4、25、37 ℃，相对湿度为75%的恒湿恒温箱中保存，每2 d取出采集膜的图像信息，共14 d。提取图像的亮度（L*）、红绿度（a*）、黄蓝度（b*）特征值，利用L*、a*、b*总变化率ΔE表征膜的颜色稳定性，按照公式（5）[22]计算。

式中：ΔL*＝L*-L0*、Δa*＝a*-a0*、Δb*＝b*-b0*；L*、a*、b*为指示膜反应后的值；L0*、a0*、b0*为指示膜反应前的值。

1.3.8 指示膜的光谱分析

采用FT-IR仪测定膜的红外光谱，采用衰减全反射附件测量，扫描次数为32，分辨率4 cm-1，测量范围4 000～500 cm-1。

1.3.9 指示膜的微观结构

用7800F型扫描电子显微镜观察指示膜的横切面结构并拍照，测量前用液氮对指示膜进行冷冻断裂，并经过真空喷金，加速电压为15 kV。

1.3.10 指示膜检测三文鱼新鲜度

取新鲜三文鱼20 g放在直径为9 cm的带盖塑料培养皿中，将膜剪切成2 cm×2 cm的正方形，粘贴在培养皿的盖子上，将培养皿放置在4 ℃的冰箱中贮存14 d，每隔2 d测一次指示膜的颜色，计算ΔE，并按照GB 5009.228—2016《食品中挥发性盐基氮的测定》测定肉的总挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量[23]；同时参考Arashisar等[24]的方法，将10 g鱼肉绞碎于烧杯中，加入90 mL蒸馏水，均质机匀浆后静置30 min，抽滤，取滤液测其pH值，重复3 次，硫代巴比妥酸反应产物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）值以每千克鱼肉中所含丙二醛质量计。参考Mousakhani-Ganjeh[25]、张新林[26]等的方法，并采取适当调整，向5 g三文鱼样品中加入15 mL、7.5%的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），均质后过滤，取滤液5 mL并加入同等体积0.02 mol/L的硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）溶液，再放于沸水中保持40 min，取出冷却后1 600 r/min离心5 min，测定上清液在532 nm波长处的吸光度。

1.4 数据统计分析

应用SPSS软件，利用Duncan's方法进行方差分析，结果用 ±s表示，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 桑葚花青素的可见光谱分析结果

图2 桑葚花青素在pH 2～12的颜色及可见光谱Fig. 2 Color and visible spectra of mulberry anthocyanin solutions at pH 2～12

如图2A所示，在pH 2～12的范围内，桑葚花青素的颜色随着pH值的升高由红色到蓝色又变为黄色，pH值小于7时，桑葚花青素颜色呈粉红色，其最大吸收峰在520 nm波长附近，pH值在7的时候，已经从520 nm开始向587 nm波长方向移动，同时最大吸收波长处的吸光度下降，pH 8～12时，花青素颜色从蓝色变为黄色，其最大吸收峰也从520 nm移至587 nm波长处。在不同的pH值下桑葚花青素颜色改变的原因是自身结构的改变。

桑葚花青素在不同pH值环境下会呈现出醌型碱、黄烊盐离子、假碱、查耳酮结构[27]。pH值小于3时，花青素主要以黄烊盐离子形式存在，溶液显现鲜艳的红色。pH值小于7时，随着酸性的减弱，花青素主要以醇型假碱或查耳酮形式存在，溶液的红色逐渐变浅。pH值大于7时，花青素主要表现为醌型碱，溶液颜色变为蓝色，且随着碱性增强由浅变深，pH 12时变为黄绿色。

2.2 内层膜正交试验结果

在单因素试验的基础上，选取结冷胶含量（A）、氯化钙浓度（B）、甘油含量（C）3 个影响因子作为考察标准，按照L9（34）正交试验设计考察这3 个影响因子对内层膜的TS和EB的影响。

由表2可以得出，三因素对机械性能的影响程度的主次顺序是A、B、C，较好的水平为A3B2C2，表明对内层膜机械性能影响程度顺序为结冷胶＞氯化钙＞甘油。结冷胶质量分数为1.5%、氯化钙含量为5 mmol/L、甘油质量分数为1.0%时，以此工艺条件进行3 次重复验证实验，得到最优组合膜的TS为（24.80±1.12）MPa，EB为（27.67±0.41）%，内层膜的机械性能最好，其中氯化钙的加入可以屏蔽结冷胶因静电作用力而产生的羧基侧链相互排斥作用，增加分子内的交联作用，提高膜的机械性能[28]；甘油是亲水性较强的增塑剂，可以增加聚合物分子链的移动性以降低膜的抗张能力，克服聚合物链之间的刚性互联引起的脆性，增加膜的弹力[29]。

表2 内层膜组分正交试验分析结果Table 2 Orthogonal array design with experimental results for formulation optimization of inner layer

2.3 指示膜的厚度与机械性能

表3 双层膜的膜厚度、含水率、水蒸气透过系数和机械性能Table 3 Thickness, water content, water vapor permeability and mechanical properties of inner and outer layers

从表3可以看出，指示膜之间的含水率存在显著性差异（P＜0.05）。空白指示膜含水率最低，外层膜壳聚糖与PVA体积比为2∶3时含水率最低，膜的厚度存在显著性差异（P＜0.05），内层膜由于是单层膜，其厚度与双层膜的差异较大。膜的TS存在显著性差异（P＜0.05），内层膜的TS最低，壳聚糖为外层膜的双层膜TS最大，这种差异是可能由于壳聚糖膜与结冷胶层的羟基数不同导致，当壳聚糖含量增加，双层膜的TS逐渐上升。膜的EB存在显著性差异（P＜0.05），当PVA含量增加，双层膜的EB率逐渐上升。此外，水蒸气可以渗透进食品包装内部，从而引起食品品质变化，由表可知，不同的膜水蒸气透过系数有显著性差异（P＜0.05），其中内层膜的水蒸气透过系数最高，这可能是由于内层膜的桑葚花青素中含有大量的酚羟基，使得膜的亲水性较好，而双层膜的水蒸气透过系数普遍较低；外层膜为壳聚糖和PVA的共混物时，膜的水蒸气透过系数相比其他较低，说明壳聚糖和PVA的相容性很好，可以很好地阻隔水蒸气。故壳聚糖和PVA体积比为1∶1时，双层膜的性能最优。

2.4 指示膜的FT-IR谱图

图3 PVA、壳聚糖、桑葚花青素、结冷胶和双层指示膜的FT-IR谱图Fig. 3 FT-IR spectra of polyvinyl alcohol, chitosan, gellan gum,mulberry anthocyanins and the bilayer film

由图3可知，在PVA和壳聚糖的红外光谱图中，3 330、3 374、3 381 cm-1和3 361 cm-1处的强峰为—OH键的伸缩振动吸收峰，双层膜吸收峰移至3 357 cm-1处，说明这些物质同时存在羟基，且发生了一定的相互作用力。2 936 cm-1和2 886 cm-1处的双峰为—CH3和—CH2伸缩振动吸收峰，低酰基结冷胶在此处存在较强的峰型，由于壳聚糖脱乙酰度较高，故壳聚糖在此处峰型比较弱[30]。1 420 cm-1为—CH伸缩振动吸收峰，在双层膜中形成了较强的峰型。1 630 cm-1处的峰为芳香环架中C＝C振动，与花青素的芳香物质对应，1 590 cm-1和1 603 cm-1为—NH2特征吸收峰，双层膜中移至1 614 cm-1，说明芳香族化合物与成膜基质间存在分子间作用力。1 154 cm-1为氨基C—N的特征吸收峰，双层膜中此处峰消失，这是反应后壳聚糖形成的—NH3+反对称变形振动吸收峰和结冷胶的羧基吸收峰重叠，可能是壳聚糖和结冷胶通过正负电荷发生了一定的络合作用[31]。PVA和壳聚糖中1 080、1 089、1 041 cm-1为C—O伸缩振动吸收峰，双层膜中对应的峰移至1 037 cm-1处，可能是复合物之间形成了分子间作用力。综上，由FT-IR谱图可知，双层膜中分子间作用力影响膜性能，而化学物质没有太大变化。

2.5 指示膜的微观结构

扫描电子显微镜图可以反映出物质之间的相容状态，相容性越好，膜的截面越均匀。由图4可知，双层膜的分层部分交联紧密，膜性质稳定。图4A中外层膜为壳聚糖/PVA时，截面之间比较规则，结构紧致，PVA分子链上含有大量羟基可与壳聚糖形成氢键，使得壳聚糖和PVA之间相容性良好；图4B中外层膜为PVA时，膜截面粗糙，交联性差，这可能是PVA结晶度高导致；图4C中外层膜为壳聚糖时，外层膜截面带有纹路，组分均一性较差，存在纤维状走向结构。对比可知，当外层膜为壳聚糖和PVA复合物时，膜的性能最好。

图4 双层膜的横切面扫描电子显微镜图Fig. 4 Scanning electron micrographs of cross sections of the bilayer film

2.6 指示膜的颜色稳定性

图5 双层膜在4（A）、25（B）、37（C）℃下贮藏14 d的颜色变化Fig. 5 Color change of the indicator film stored at 4 (A), 25 (B) or 37 (C) ℃ for 14 days

比较了不同比例外层结构的双层膜在不同温度下（4、25、37 ℃）的颜色稳定性，从图5可知，当温度升高时，花青素颜色稳定性降低，4 ℃时的稳定性明显高于25 ℃，25 ℃的稳定性高于37 ℃，温度越高，花青素的降解速率越快，并使得花青素结构二苯基苯并吡喃阳离子转变为无色的假碱与查耳酮[32]。当外层膜壳聚糖和PVA的体积比为1∶1时，花青素稳定性表现最好，说明两者的结合度最高，能防止内层花青素跟外层环境的接触，抑制外界氧气对内层花青素的氧化作用；单独为内层膜时稳定性较低，因为色素裸露在环境中，加速了花青素氧化作用，膜的自身稳定性降低[33]。

2.7 双层膜用于指示三文鱼新鲜度

选用体积比为1∶1的外层壳聚糖和PVA制备双层膜，用于指示三文鱼新鲜度。TVB-N是指肉类在腐败过程中，蛋白质分解产生的氨类等碱性物质，其含量是一种反映鱼肉新鲜度的主要指标。GB 2733—2015《鲜、冻动物性水产品》规定海水鱼类TVB-N含量不高于30 mg/100 g为新鲜肉[34]。鱼肉在贮藏初期产生乳酸降低环境中的pH值，但随着贮藏时间的进一步延长，肉中的蛋白质在微生物作用下分解为氨、三甲胺等碱性含氮物质，造成pH值上升，因此pH值变化可较好地评价鱼肉的新鲜度情况[35]。TBA值是描述脂肪氧化程度的指标，三文鱼中所含有的不饱和脂肪酸在低温贮藏过程中与氧气反应发生酸败，因此用TBA值的变化来判断三文鱼的新鲜度，一般情况下鱼肌肉中TBA值达到1～2 mg/kg时鱼肉腐败[26,36]。从图6可以看出，三文鱼在4 ℃贮藏6 d时TVB-N含量为33.14 mg/100 g，TBA值为0.921 mg/kg，pH值为6.75，此时，三文鱼呈不新鲜状态，指示膜颜色明显变化，由暗红变为淡紫色，最后变成蓝褐色，是肉眼明显可见的范围，说明指示膜的颜色变化和三文鱼品质信息关系密切，可以肉眼进行颜色辨别，因此该指示膜可用于指示三文鱼新鲜度。

图6 三文鱼4 ℃贮藏下TVB-N含量、TBARS值、pH值和双层膜的色差变化Fig. 6 Changes in TVB-N content and TBARS value of salmon samples during storage and change in ΔE of the indicator film corresponding to pH

3 结 论

本研究利用PVA和壳聚糖的共混物制成外层膜，结冷胶和桑葚花青素制成内层膜，得到的双层膜用于三文鱼新鲜度指示。桑葚花青素在不同pH值下呈现不同的颜色，本实验通过对外层膜基质的比例进行比较分析，得到了外层膜PVA和壳聚糖的体积比为1∶1时，水蒸气透过率最低，膜机械性能、截面相容性以及膜的自身稳定性最好。FT-IR图表明成膜基质之间形成一定的相互作用力，膜性质稳定。将双层膜用于三文鱼新鲜度指示，当三文鱼贮藏6 d时，通过肉眼可以直观看到膜颜色从由暗红变为淡紫色，最后变成蓝褐色。此时，TVB-N含量为33.14 mg/100 g，TBARS值为0.921 mg/kg，pH值为6.75，说明三文鱼已经腐败。结果表明，包含桑葚花青素制成的双层膜既可降低花青素氧化作用提高其稳定性，又可用于三文鱼新鲜度指示，具有良好的应用潜力。