重组结核分枝杆菌11 kDa蛋白鉴别潜伏性结核感染与卡介苗接种的研究

赵爱华 康万里 王国治 高正伦 都伟欣 卢锦标 沈小兵 苏城 徐苗 郑素华

重组结核分枝杆菌11 kDa(相对分子质量为11 000)蛋白(简称“重组11 kDa蛋白”)是选择卡介苗特异性丢失并与结核毒力相关的ESAT-6基因，经大肠埃希菌表达的结核分枝杆菌特异性的重组蛋白[1]。临床前研究证实，该变态反应原可有效鉴别结核分枝杆菌感染与卡介苗接种，以及龟-脓肿分枝杆菌等非结核分枝杆菌感染，甚至可以鉴别结核分枝杆菌活菌感染和灭活结核分枝杆菌致敏的豚鼠，具有良好的安全性[2-3]。临床研究显示，重组11 kDa 蛋白安全性好，并与γ-干扰素释放试验(IGRA)检测结果一致性良好[4-8]。将其作为新型结核变态反应原，结合皮肤试验，有可能成为一种简单便捷、特异性高的潜伏性结核感染筛查的体内诊断试剂。本研究拟对重组11 kDa蛋白进行两方面评价，一是作为潜伏性结核感染筛查诊断试剂进行评价，二是作为潜伏性结核感染与卡介苗接种鉴别诊断试剂进行评价。在评价重组11 kDa蛋白时，同时进行IGRA与结核菌素纯蛋白衍生物(TB-PPD)皮肤试验的平行试验，比较其与两种方法检测结果的一致性，为临床应用提供研究基础。

资料和方法

一、研究对象

由首都医科大学附属北京胸科医院联合北京市昌平区结核病防治所、北京市怀柔区结核病防治所和北京市大兴区结核病防治所，在以上3个区的高校和工厂招募健康志愿者，招募时间为2014年7月至2016年3月。

纳入条件：年满18周岁，签署知情同意书，身体健康。排除标准：(1)入组前曾与肺结核患者，特别是排菌患者密切接触；(2)患有各种重要脏器疾病、糖尿病、自身免疫疾病、器官移植术后、接受免疫抑制剂或免疫增强剂治疗、长期服用激素；(3)确定为人类免疫缺陷病毒感染或相关疾病；(4)患急性传染病(如麻疹、百日咳、流行性感冒、肺炎)、急性眼结膜炎、急性中耳炎、癫痫或精神疾病者；(5)肺内、外结核病，呼吸道症状不适者；(6)正在参加其他临床试验者，或在临床试验前3个月参加过其他任何临床试验者；(7)妊娠或哺乳期妇女；(8)过敏体质者，如对2种以上药品或食物有过敏史者，或对本试剂组分有过敏者；(9)怀疑或确有药品滥用、酗酒史；(10)知情退出者。经过测量身高，以及进行体质量、脉搏、血压、胸部X线摄影(简称“胸片”)、血常规、血生化(肝功能和肾功能)、尿常规检查，各项指标正常者入组，总计纳入3001名。其中，男1611名，女1390；年龄18～65岁，中位年龄29岁。3001名志愿者中，记录了2379名志愿者的卡痕信息，其中922例存在卡痕。

本研究经首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会批准，批准编号为2013-16。

二、试剂

重组11 kDa蛋白、TB-PPD、皮内注射用卡介苗和安慰剂由北京祥瑞生物制品有限公司提供。市售γ干扰素(IFN-γ)酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)试剂盒购自英国Oxford Immunotec有限公司。

三、研究方法

1. 皮肤试验：皮肤试验采用同体双臂分别对受试者进行重组11 kDa蛋白和TB-PPD皮肤试验。于受试者右侧手臂掌侧前1/3处皮内注射0.1 ml 重组11 kDa蛋白(10 μg/ml)，同时于左侧手臂相同位置注射0.1 ml TB-PPD(50 U/ml)，注射方法严格遵守《结核菌素皮肤试验使用指导手册》[9]。分别于注射后24、48、72 h测量重组11 kDa蛋白及TB-PPD皮肤反应的硬结和红晕[记录平均直径，平均直径=(最大横径+最大纵径)/2]。试验结果以72 h为准[9]，同时记录局部水疱、坏死、淋巴管炎等情况。重组11 kDa蛋白皮肤试验判定标准：红晕及硬结平均直径≥5 mm为阳性；以及无论平均直径大小，只要局部出现水疱、双圈、坏死或淋巴结炎也为阳性；红晕及硬结平均直径<5 mm为阴性。TB-PPD皮肤试验判定标准与上述判定方法相同。

2. IGRA：采用结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT.TB)试剂盒进行检测。所有试验对象在皮肤试验前均采集外周抗凝静脉血不少于10 ml，应用淋巴细胞分离液制备外周血单个核细胞，每孔加入细胞1.0×106个。按试剂盒操作说明加入刺激原。判定标准：空白对照孔斑点数为0～5个时，用测定孔A和(或)测定孔B斑点数减去空白对照孔斑点数后结果≥6个；或空白对照孔斑点数≥6个时，测定孔A和(或)测定孔B斑点数≥2倍的空白对照孔斑点数，则判定为阳性。相反为阴性。

3. 卡介苗接种鉴别：在3001名志愿者中，3种检测结果均为阴性的475名知情同意受试者，采用数字表法按随机双盲的原则，以2∶1的比例接种卡介苗和安慰剂，受试者首先进行生命体征的测量(主要包括体温、心率和血压)，正常受试者接受疫苗/安慰剂接种后在现场观察30 min，无异常反应方可离开。接种安慰剂或卡介苗3个月(12周)后再次进行平行对照试验。试验开始前再次对志愿者进行脉搏、血压、体温、血常规、肝功能、肾功能、尿常规等检查，然后进行重组11 kDa蛋白和TB-PPD的同体双臂皮试试验和IGRA检测。分别于注射变态反应原后24、48、72 h观察皮肤试验局部反应和全身反应，并采用米尺测量皮肤硬结的横径和纵径，计算每日硬结平均直径。记录所有的反应，以72 h结果进行判定。

四、统计学处理

应用Excel 2007软件建立数据库，统计分析采用SAS 8.2和Stata 14.0软件。计数资料的统计描述以“百分率(%)”表示，组间阳性率的比较采用配对χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。组间一致性的评价采用“一致率(%)”和“一阶一致性系数(the first-order agreement coefficient，AC1)”。AC1值是评价校正机会一致性因素后的一致性程度，其应用受结局分布情况影响程度较小，是评价诊断试验结局一致性更为稳定的指标；AC1值越大表示一致性程度越高，AC1值≥0.75表示一致性好[10-11]。一致率和AC1值的计算方法为：一致率(%)=两种方法判定结果相同的例数/总例数×100%；AC1值=(观察一致性-机会一致性)/(1-机会一致性)。

结 果

一、健康志愿者潜伏性结核感染筛查结果

3001名志愿者中，选用重组11 kDa 蛋白作为潜伏性结核感染筛查试剂，检测阳性率为32.2%(966/3001)；体外IGRA检测阳性率为34.4%(1033/3001)；TB-PPD检测阳性率为47.7%(1430/3001)。IGRA检测阳性率与重组11 kDa蛋白相比，差异有统计学意义(χ2=22.787，P<0.001)；IGRA与重组11 kDa蛋白检测一致率为93.4%(2804/3001)，AC1值为0.882(95%CI=0.866～0.898)，两者具有较好的一致性。TB-PPD检测阳性率高于重组11 kDa蛋白，差异有统计学意义(χ2=182.146，P<0.001)；TB-PPD与重组11 kDa 蛋白检测一致率为60.6%(1819/3001)，AC1值为0.243(95%CI=0.207～0.279)，两者的一致性较差。

二、卡介苗接种鉴别结果

475名3种检测方法均为阴性的志愿者中，326名参加了卡介苗接种鉴别评价，其中失访8名，318名志愿者接种3个月(12周)后再次进行平行对照试验；149名接种安慰剂，其中失访2名，147名志愿者接种3个月(12周)后再次进行平行对照试验。共计465名完成评价。

接种卡介苗的志愿者中，重组11 kDa蛋白作为潜伏性结核感染检测试剂，检测的阳性率为1.3%(4/318)；IGRA检测的阳性率为3.1%(10/318)；TB-PPD检测的阳性率为56.3%(179/318)。重组11 kDa蛋白检测阳性率与IGRA相比，差异无统计学意义(χ2=2.571，P=0.109)；一致率为95.6%(304/318)，AC1值为0.954(95%CI=0.929～0.979)，两者具有较好的一致性。TB-PPD检测的阳性率高于重组11 kDa蛋白，差异有统计学意义(χ2=167.350，P<0.001)。重组11 kDa蛋白与TB-PPD一致率为42.5%(135/318)，AC1值为0.025(95%CI=-0.106～0.155)，两者的一致性较差。

接种安慰剂的志愿者中，重组11 kDa 蛋白作为潜伏性结核感染筛查试剂，检测的阳性率为4.1%(6/147)；IGRA检测的阳性率为1.4%(2/147)；TB-PPD检测的阳性率为17.7%(26/147)。重组11 kDa蛋白与IGRA阳性率的比较，差异无统计学意义(χ2=2.667，P=0.109)；重组11 kDa蛋白与IGRA的一致率为95.9%(141/147)，AC1值为0.957(95%CI=0.921～0.993)，两者具有较好的一致性。TB-PPD检测的阳性率高于重组11 kDa蛋白，差异有统计学意义(χ2=15.385，P<0.001)；重组11 kDa蛋白与TB-PPD的一致率为82.3%(121/147)，AC1值为0.781(95%CI=0.690～0.871)，两者具有较好的一致性。

讨 论

潜伏性结核感染是指宿主感染结核分枝杆菌后对结核分枝杆菌抗原存在持续的免疫应答，但无临床活动性结核病证据的一种特殊状态[12]。潜伏性结核感染者约有5%～10%的概率会发展为活动性结核病[13]，为了更好地抑制结核病，控制传染源，对潜伏性结核感染的筛查十分必要。

结核菌素皮肤试验曾一度作为潜伏性结核感染的筛查方法，并据此估计了世界1/3的人口为潜伏性结核感染者[14]。但由于TB-PPD所含抗原成分复杂，与卡介苗及部分环境分枝杆菌存在交叉抗原，并不能有效区分卡介苗接种和结核感染，因此，在诊断潜伏性结核感染方面特异性较差。IGRA是近年发展起来的新型体外诊断方法，敏感度和特异度均较高，不受卡介苗接种及绝大部分非结核分枝杆菌的影响。但IGRA对实验技术和条件要求较高，且价格昂贵，难以实现高通量检测，WHO等国际组织并不推荐将IGRA作为中低收入国家潜伏性结核感染的筛查手段[15]。我国作为普遍接种卡介苗的国家，也是结核病高负担国家，潜伏性结核感染人数巨大，需要简便、特异和高通量的新型诊断方法。

为解决这一问题，选择结核分枝杆菌中存在而卡介苗中丢失的ESAT-6基因，构建重组11 kDa蛋白，采用皮肤试验方法，根据已感染结核分枝杆菌个体体内存在致敏的T淋巴细胞，再次接触结核分枝杆菌或微量的结核分枝杆菌特异蛋白时，会产生迟发型细胞过敏反应，即Ⅳ型变态反应的原理，通过变态反应情况诊断机体是否感染结核分枝杆菌。

本研究将重组11 kDa蛋白用于健康人群潜伏性结核感染筛查的结果可见，其检测阳性率与IGRA有较好的一致性。而与TB-PPD阳性率的一致性较差。而本研究中健康人群中至少有1/3已存在卡介苗接种过的卡痕，进一步说明了TB-PPD特异度差的缺陷。

将重组11 kDa蛋白用于卡介苗接种者中，其阳性率与IGRA结果基本一致；而与TB-PPD阳性率一致性较差。而在安慰剂接种人群中，重组11 kDa蛋白检测结果与IGRA结果及TB-PPD结果的一致性均较好。由于TB-PPD既能用于结核病的临床诊断，又能用于卡介苗接种后机体免疫反应的监测，在该研究中，卡介苗接种后的人群在疫苗接种3个月后使用TB-PPD进行结核感染的筛查，则大部分皮肤试验阳性人群应为卡介苗接种后的阳性反应，而非感染结核的阳性反应，该结果也同时说明PPD无法区分卡介苗接种与结核感染，进一步证明了TB-PPD用于结核感染检测特异度差。

综上所述，本研究证实了重组11 kDa蛋白能鉴别卡介苗接种与结核感染，能克服PPD特异度差的缺陷。检测结果与IGRA有较好的一致性，同时又避免了IGRA的操作繁琐、难以实现高通量和试剂价格昂贵的问题。重组11 kDa蛋白在操作方法上有PPD 的方便性，在检测结果上有IGRA的特异性，结合了两种试剂的优点，经过大规模的临床评价，将为潜伏性结核感染筛查提供一种准确、简便的候选筛查试剂。