人高致病性冠状病毒感染的免疫病理损伤及其机制*

李紫薇，杨东亮，刘 嘉

华中科技大学同济医学院附属协和医院感染性疾病科，武汉 430022

2019年12月下旬，湖北省武汉市卫生机构报告了多起不明原因肺炎的聚集性病例。2020年1月初，不明原因肺炎的病原体被确定为一种新的冠状病毒，该致病病毒被暂命名为2019新型冠状病毒(2019 novel coronavirus，2019-nCoV)[1]，后又于2020年2月11日被国际病毒分类委员会建议命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒-2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)。迄今为止，除中国外已有其他206个国家和地区相继报告了SARS-CoV-2的确诊病例，世卫组织总干事于2020年1月30日宣布SARS-CoV-2的爆发构成国际关注的突发公共卫生事件。根据世界卫生组织每日疫情报告，截至北京时间2020年4月9日17时，在中国已有83249例SARS-CoV-2确诊病例和3344例死亡病例，在其他206个国家和地区已有1352949例确诊病例和82178例死亡病例。

冠状病毒宿主广泛，包括人和多种野生动物，可引起呼吸道、肠道、肝脏和神经系统等多组织器官疾病。截止目前，SARS-CoV-2是可感染人类的第7种冠状病毒，也是第3种已知的人高致病性冠状病毒。另外2种高致病性冠状病毒，严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)也曾于近些年来出现爆发流行，并具有较高的死亡率[2-3]。SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2感染在临床表现上有诸多相似之处，患者起病以呼吸道症状为主，部分重症患者会进展为急性肺损伤及严重急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)及多器官功能衰竭等[4-5]。既往针对高致病性冠状病毒感染发病机制的研究显示，除病毒直接感染细胞诱导的细胞病变效应外，病毒感染引发的免疫病理损伤在疾病重症化的过程中发挥了重要作用。本文对SARS-CoV、MERS-CoV及新发现的SARS-CoV-2感染过程中的免疫病理损伤及其机制加以总结与讨论，以期为制订有效的临床治疗策略提供理论依据。

1 SARS-CoV感染的免疫病理损伤及机制

通过对SARS-CoV感染死亡病例的解剖，可以观察到肺部水肿及多处充血，肺门和腹腔淋巴结肿大，肺脏重量增加，脾脏体积及重量减少，肺组织学检查显示肺间质及肺泡内有广泛的中性粒细胞和巨噬细胞浸润、支气管上皮脱落、纤毛脱落和鳞状上皮化生[6-8]。SARS-CoV感染早期的肺部组织病理学特征通常与急性弥漫性肺泡损伤有关，而后期表现为弥漫性肺泡损伤合并急性纤维素性机化性肺炎[9]。在循环淋巴细胞、单核细胞和淋巴组织中，以及呼吸道上皮细胞、肠黏膜、肾远端小管上皮细胞、脑内神经元和驻留在不同器官中的组织内巨噬细胞中均可检测到大量的SARS-CoV颗粒和核酸[8]，这些细胞表面均表达SARS-CoV的受体血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme，ACE2)，病毒可通过ACE2进入上述细胞[10]。免疫荧光原位杂交和电镜检查均显示SARS-CoV RNA和细胞角蛋白在肺内共定位，提示了肺泡上皮细胞被SARS-CoV感染[11-12]。此外，肺泡巨噬细胞中偶见SARS-CoV[12]。

迄今为止，对SARS-CoV感染的发病机制所知仍非常有限。SARS-CoV感染患者的弥漫性肺损伤可能与以下因素相关：①高初始病毒滴度[13]；②肺内单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞浸润增加[6]；③血清促炎细胞因子和趋化因子水平升高[14]。因此，SARS-CoV感染的重症化可能是由于病毒感染直接诱导的细胞病变效应和高细胞因子血症或“细胞因子风暴(cytokine storm)”引起的免疫病理损伤共同作用的结果。对SARS-CoV感染期间细胞因子/趋化因子谱变化的研究表明，循环中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白细胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8和CXCL10等细胞因子/趋化因子水平的升高，可能是导致SARS-CoV感染患者预后不良的原因[15]。相较于非重症SARS患者，重症患者的血清促炎细胞因子如IL-1、IL-6、IL-12、IL-8、干扰素(interferon，IFN)-γ和转化生长因子-β(transforming growth factor，TGF-β)及趋化因子CCL2、CXCL9和CXCL10的水平明显升高(P<0.01)[14，16-18]。此外，通过早期诱导CXCL10和IL-2，导致IL-6的产生过多和IL-10的产生不足被认为是造成SARS-CoV感染期间肺损伤的免疫病理过程[17]。干扰素γ诱导蛋白-10(interferon γ-induced protein 10，IP-10)和IL-2在趋化和活化单核/巨噬细胞方面发挥重要作用[19-21]，而后者是SARS患者肺部主要炎症细胞类型[6]。在SARS-CoV感染急性期，可在患者血清中检测到高水平的IP-10和IL-2[16-17，22]。因此，IP-10和IL-2可能通过活化单核/巨噬细胞介导SARS感染过程中肺部的免疫病理损伤。Gralinski等[23]的研究证实，补体系统是SARS-CoV诱导疾病的重要宿主介质，补体系统激活可通过上调包括粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony stimulating factor，GCSF)、IL-6、TNF-α等多种细胞因子和趋化因子的水平，介导SARS-CoV感染的炎症进展。此外，IFN-α、IFN-γ和干扰素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的持续高表达与SARS病情早期恶化相关[24-25]。研究表明，SARS-CoV感染导致Ⅰ型IFN表达延迟[26]，I型IFN信号转导延迟与病毒活跃复制共同促进了促炎细胞因子和炎症单核/巨噬细胞(inflammatory monocyte-macrophages，IMMs)的聚集，导致肺内细胞因子/趋化因子水平升高，血管渗漏和病毒特异性T细胞反应受损[27]。同时，Ⅰ型IFN可通过致敏T细胞使其凋亡，进而导致病毒特异性CD8+和CD4+T细胞数量减少[28]。CD4+T细胞消耗会引起肺内淋巴细胞的募集减少及中和抗体和细胞因子减少，进而导致强烈的免疫反应介导的间质性肺炎及肺内病毒清除延迟[29]。

2 MERS-CoV感染的免疫病理损伤及机制

研究表明，MERS-CoV感染的病理特征包括渗出性弥漫性肺泡及肺透明膜损伤、肺水肿、Ⅱ型肺细胞增生、以淋巴细胞为主的间质性肺炎和多核合胞细胞、支气管黏膜下腺坏死等[30-31]。上述支气管病变是MERS-CoV感染致呼吸衰竭的病理基础[32]。MERS-CoV在肺部感染的靶细胞包括肺泡上皮细胞、呼吸道上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞和支气管黏膜下腺细胞等[30]，这些细胞表面表达的多功能蛋白二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase 4，DPP4)是MERS-CoV进入细胞的主要受体[33]。电镜下观察可见，病毒颗粒存在于肺泡上皮细胞、肺巨噬细胞、浸润骨骼肌的巨噬细胞和肾近曲小管上皮细胞中[31]。1例MERS-CoV感染患者的肾穿刺活检显示其出现了急性肾小管间质肾炎、急性肾小管硬化及蛋白管型的形成，这与MERS-CoV的组织学定位一致[34]。

MERS-CoV的受体DPP4广泛表达于肾、肺泡、小肠、肝脏、前列腺上皮细胞和活化的白细胞[35]，提示MERS-CoV拥有更广的组织学分布范围[36]。与SARS-CoV不同的是，MERS-CoV能够感染许多人类免疫细胞，包括树突状细胞[37]、巨噬细胞[38]和T细胞[39]。MERS患者肺部病变的严重程度与肺部中性粒细胞和巨噬细胞的广泛浸润以及外周血中这些细胞的较高数量相关[30]。MERS-CoV感染的树突状细胞和巨噬细胞可持续产生多种促炎细胞因子和趋化因子，如TNF-α、IL-6、IL-8、CXCL10、CCL2、CCL3和CCL5[37-38]，但其产生时效有所延迟[38，40]。这些细胞因子的促炎和趋化作用被认为与免疫细胞浸润下呼吸道及严重的炎症和组织损伤有关。最近的研究表明，与轻中度MERS-CoV感染患者相比，重度MERS-CoV感染患者血清促炎细胞因子(如IL-6和IFN-α)和趋化因子(如IL-8、CXCL10和CCL5)水平升高[41-42]。与健康人相比，MERS-CoV感染患者血清IFN-α2、IFN-γ、TNF-α、IL-15、IL-17、IL-10表达明显升高，表现为明显的Th1型和Th17型炎症反应[43]。

CD4+和CD8+T细胞在MERS-CoV感染过程中均发挥重要的抗病毒作用，然而CD4+T细胞对MERS-CoV感染更为敏感，这可能进一步导致B细胞功能受损[44-45]。被MERS-CoV感染的人CD4+和CD8+T细胞中，外源性和内源性凋亡途径均被激活[39，45]。MERS-CoV正是通过这种机制逃避外周血和淋巴器官中的T细胞应答，而这也可能是造成病毒传播和严重免疫病理损伤的原因之一[39]。有研究表明，DPP4受体在T细胞信号转导、活化和共刺激方面发挥重要作用，而MERS-CoV可通过下调DDP4进而损伤T细胞功能[46]。此外，据报道，MERS-CoV还可以通过上调Smad7和成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2，FGF2)的表达来诱导肾和肺泡上皮细胞凋亡[47]。

3 SARS-CoV-2感染的免疫病理损伤及机制

宏基因组测序结果表明，SARS-CoV-2属于β冠状病毒属，与SARS-CoV及MERS-CoV分别有79.0%和51.8%的核苷酸同源性[48]。据报道，SARS-CoV-2基因组与蝙蝠冠状病毒有96%同源性[49]。SARS-CoV-2被证实通过ACE2受体感染靶细胞[49]。体外实验表明，将SARS-CoV-2接种到人气道上皮细胞表面层会导致细胞病变和细胞纤毛跳动停止[4]。通过对SARS-CoV-2感染造成的聚集性疫情分析，本身患有基础疾病等合并症的老年男性更为易感，并可导致严重甚至致命的呼吸道疾病[50-52]。SARS-CoV-2感染首发临床症状主要包括发烧、干咳、肌痛、疲劳和腹泻等[53]。若患者病情进展，将出现大量肺泡损伤、进展性呼吸衰竭、淋巴细胞减少甚至死亡[5，50，53-54]。一项对658名SARS-CoV-2患者的回顾性研究显示，大多数感染者均合并有器官功能损伤，其中35例(67%)合并ARDS，15例(29%)合并急性肾损伤，12例(23%)合并心脏损伤，15例(29%)合并肝功能障碍，1例(2%)合并气胸[52]。通过对一例COVID-19死亡尸体的系统解剖，可观察到死者肺部损伤明显，存在炎性病变(灰白色病灶)，肺泡内含大量黏稠分泌物，并可见纤维条索[55]。而对COVID-19遗体的穿刺组织病理学研究也观察到类似的现象，即肺组织呈现肺泡内渗出性炎、肉质变、间质炎和纤维化等多样性病变，肺泡腔内可见透明膜形成并存在单核/巨噬细胞浸润，肺泡和肺间质可见少量CD4+T细胞[56]，Tian等[57]的研究还发现了由于间质成纤维细胞和Ⅱ型肺泡细胞增生导致的肺泡壁弥漫性增厚。通过对一例死于COVID-19患者的肺、肝及心脏的组织样本的组织学检查，可见双肺弥漫性肺泡损伤和细胞纤维黏液样渗出物，其中右肺可见明显的肺泡上皮细胞脱屑和肺透明膜形成，提示ARDS；左肺显示肺水肿伴透明膜形成，也提示早期ARDS[58]。双肺间质均可见以淋巴细胞为主的单个核细胞炎性浸润。肺泡内可见表现为病毒样细胞病变的多核合胞细胞，但未发现明显的核内或胞质内病毒包涵体[58]，以上COVID-19的肺部病理特征与SARS-CoV或MERS-CoV感染非常相似，即病理学改变主要为靶向于双肺的弥漫性肺泡损伤、水肿和肺透明膜形成，表现为以单核巨噬细胞和淋巴细胞渗出为主的炎性细胞浸润和肺泡上皮细胞损伤[59]。此外，该患者的肝组织样本显示微血管中度脂肪变性和肝小叶及门脉轻度活动性炎症，表明损伤可能是由SARS-CoV-2感染或药物诱导的肝损伤造成的[58]。心脏组织除间质中有少量单核炎症细胞浸润，无其他实质性损害，提示SARS-CoV-2可能不直接损害心脏[58]。通过流式细胞术，可发现该患者外周血CD4+和CD8+T细胞数量明显减少且处于过度激活状态[58]。CD4+T细胞中高度促炎的CCR4+CCR6+Th17细胞频率升高[58]。CD8+T细胞中含有高浓度的颗粒溶素及穿孔素等细胞毒颗粒。以上T细胞的过度活化，即Th17细胞的增加和CD8+T细胞的细胞毒作用是造成该患者严重免疫损伤的部分原因。通过对44例COVID-19患者外周血的淋巴亚群分析观察到了类似的结果，即COVID-19患者外周血B细胞、T细胞和NK细胞总数较健康人明显降低，且与非重症组相比，重症组该3类细胞总数下降更为明显[60]。同时，COVID-19患者外周血辅助性T细胞(CD3+CD4+)和抑制性T细胞(CD3+CD8+)水平较健康人也明显降低[60]。

另一项来自33位COVID-19患者的血液学数据显示，相较于存活患者，死亡患者的中性粒细胞计数、D-二聚体、血尿素和肌酐水平持续升高，淋巴细胞计数持续下降[54]。中性粒细胞增多可能与病毒入侵引起的细胞因子风暴有关，凝血激活可能与持续性炎症反应有关，而急性肾损伤可能与病毒、缺氧和休克的直接作用有关，以上免疫病理损伤可能与患者的死亡有关[54]。与健康人相比，SARS-CoV-2感染患者的血浆IL-1β、IL-1Ra、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、FGF、GCSF、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IFN-γ、IP-10、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1，MCP1/CCL2)、CCL3/MIP1α、CCL4/MIP1β、血小板源生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)、TNF-α和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)水平更高，其中高水平的IL-1β、IFN-γ、IP-10及MCP1可能导致活化的Th1细胞反应[50]。此外，ICU患者血浆IL-2、IL-7、IL-10、GCSF、IP-10、MCP1、MIP1α和TNF-α水平均高于非ICU患者[53]，这表明细胞因子风暴参与了疾病的进展。与SARS-CoV不同的是，SARS-CoV-2感染还启动了发挥炎症抑制作用的Th2型细胞因子，如IL-4和IL-10的分泌[50]。以上结果表明，免疫病理损伤在COVID-19的发生发展中也可能起到相关作用。

4 总结与展望

炎症反应是消除病原体过程中不可缺少的一部分。炎症反应通过识别病原体、调节相关细胞因子或趋化因子的分泌和表达，介导免疫细胞募集和浸润，并最终达到消除病原体、修复组织及恢复机体稳态的目的。然而，当如SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2这些高致病性病毒攻击人体时，会导致过度或时间过长的细胞因子/趋化因子反应，免疫细胞功能受损、过度活化或凋亡等，上述一系列事件造成的免疫病理损伤导致了疾病的重症化。鉴于目前没有针对SARS-CoV、MERS-CoV或SARS-CoV-2的特异性抗病毒药物，临床治疗中可以通过减少病毒诱导的直接细胞病变效应和抑制宿主炎症反应的治疗(例如通过中和细胞因子或其同源受体的抗体或化合物，如抗IL-6、抗IL-6R或抗IL-1β)，以减轻病毒感染过程中的免疫病理损伤。