基因与干细胞治疗感音神经性聋的研究现状

王新兰田海月钟翠萍向大伟

1中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院耳鼻咽喉头颈外科（兰州730050）

2宁夏医科大学临床学院研究生院（银川750004）

3中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院（兰州730050）

感音神经性聋是世界上发病率最高的致残性感官缺陷，严重影响患者的生活质量，尤其是在儿童时期，可能导致言语和语言的发育延迟。2016年全国听力障碍与耳病调查显示，我国中度以上听障人口达7106万，SNHL占比达70%以上。2012年世界卫生组织统计，超过5.3%的世界人口（约3.6亿人）患有致残性听力障碍，其中四分之一的听力障碍始于儿童时期，80%的聋人和听力障碍者生活在低收入和中等收入国家[1]。

目前临床对于SNHL的治疗主要有助听器、振动声桥、人工耳蜗植入等[2]，尽管这些技术近些年取得了一定进展，但患者感知到的声音与“先天性”耳蜗的声音存在差别，且并非所有的SNHL患者都适合这些方法，这说明当前技术并不能从根本上解决耳聋问题。因此，如何修复受损的HCs和SGNs，恢复其功能已成为耳科研究的热点。来自世界各地的科学家正在探索修复受损HCs和SGNs形态和功能的治疗方法，其中有学者提出利用细胞或基因治疗技术来替代或修复损伤细胞。随着基因与干细胞技术的迅速发展，动物模型中的方法取得了可喜的进展，科学家主要尝试从三方面恢复HCs数量及内耳功能，其一是用实验方法靶向敲除限制HCs分化的基因;其二是应用基因转染技术诱导HCs分化再生;其三是利用各种干细胞移植代替死亡的HCs。本综述讨论了基因与干细胞治疗SNHL的研究现状，并探讨了当前阻碍其临床应用的可能障碍和局限性。

1 干细胞治疗SNHL

1.1 干细胞的研究背景

干细胞疗法的临床应用始于1968年，最初干细胞用于骨髓移植术，其有效成分是造血干细胞。此后，随着干细胞研究方法及临床技术的不断改进，干细胞治疗在临床的应用越来越广泛。现有临床研究已经证明，干细胞对神经退行性疾病、免疫疾病、心脑血管疾病、生殖系统疾病以及肝、肾、胰等器官的重大疾病治疗方面发挥重要作用，并展现出惊人的治疗潜力，其安全性及有效性逐渐得到医学界的认可[3]。作为一种新的治疗方法，干细胞疗法正在尝试用于治疗SNHL患者。哺乳动物的HCs和SGNs在出生以前就停止生长了,耳蜗HCs和SGNs损伤后都不能再生和修复，而干细胞在适宜的条件下可以分化为几乎所有的细胞类型，因此，利用干细胞修复受损的HCs和SGNs，恢复其功能成为听力学研究的热点。

干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有自我复制、再生为各种组织器官的潜能、自动归巢、免疫原性低、良好的与宿主细胞整合能力、作为细胞载体导入相应的外源基因以及极强的迁徙能力,迁徙到耳蜗病变组织[4]。在一定条件下，它可以分化为多种功能细胞，因此被医学界称为“万能细胞”，以上特点决定了干细胞疗法在SNHL患者治疗中可能具有潜在的应用价值。目前可用于SNHL患者耳蜗修复的干细胞主要有以下几种:胚胎干细胞、造血干细胞、神经干细胞、骨髓间充质干细胞、诱导多能干细胞和内耳干细胞[5]。

1.2 干细胞治疗SNHL的研究现状

SNHL是由毛细胞的缺失或涉及到听觉皮质的传入神经通路（主要病变为耳蜗HCs和/或SGNs变性或缺失）的损伤引起，这类患者主要由耳毒性药物、噪音、老化和遗传因素等多种因素造成[6,7]。因此，HCs和SGNs再生是治疗SNHL的重要目标。助听器和耳蜗植入是目前中重度SNHL患者重返听觉世界的唯一希望，但仍有很多局限性，例如佩戴助听器患者，需要一定的残余听力；人工耳蜗植入患者，必须经过术后训练建立植入物与大脑之间的有效信号传输，而极重度SNHL患者两者效果都不佳。干细胞以其良好的融入宿主组织的能力而闻名，并已成功应用于大脑、脊髓和眼睛等几项移植实验，以替换受损的神经元和感觉细胞。近年来，干细胞被引入哺乳动物耳蜗HCs再生新治疗策略的研究中，初步结果表明，移植的干细胞能够迁移或移植到耳蜗和前庭末端器官以及螺旋神经节，代替受损的HCs和SNGs，这表明干细胞在一定程度上可以达到治疗SNHL的目的。

利用干细胞治疗SNHL目的是通过诱导干细胞到耳蜗病变所需部位来恢复正常细胞的功能。就听力损失来说，干细胞有分化为新的毛细胞、神经元和支持细胞的潜能。文献报道骨髓源性间充质干细胞（MSCs）是最有前景的用来修复内耳细胞之一,且原发性间充质干细胞在内耳存活时间最长[8]。MSCs具有显著的自我更新能力，不仅能分化成成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞，而且能分化成神经元[9,10]。与其他细胞类型相比，MSCs的最大优势是可用于自体移植[11]。先前的研究表明，胚胎干细胞、神经干细胞、脐带血干细胞、诱导多能干细胞和成人内耳干细胞可以产生内耳神经元或类毛细胞样细胞[12]。

张等人[13]将来源于C57bl的神经干细胞通过耳蜗侧壁移植到小鼠内耳中，发现它们能高效地分化为听觉神经元。在另一项研究中，Mi等人[14]将耳毒性药物（新霉素）注射到正常听力豚鼠内耳中，人为的引起SNHL，观察到豚鼠的听觉诱发脑干反应（ABR）阈升高至80-90dB，并在光学显微镜下观察到外毛细胞变性和听神经元缺失。然后他们从孕妇脐血中采集间充质干细胞，经肱静脉移植到豚鼠耳内，5周后ABR阈值从80-90dB提高到40dB，听觉神经元和HCs的数量也增加。由此，他们得出结论：从脐血中静脉移植间充质干细胞可以通过增加外毛细胞和听神经元的数量来提高听力。Chien等人[15]经颅内途径将人源性间充质干细胞（HL-MSCs）移植入小鼠耳蜗神经，并在耳蜗神经干周围用微量移液管注射HL-MSCs，通过ABR和耳声发射（DPOAE）测定小鼠的听觉阈值。然后用哇巴因诱导听觉阈值升高但DPOAE正常的小鼠发生听神经病，采用免疫组织学染色，检测HL-MSCs在细胞移植2天后定位于耳蜗神经干，移植3个月后，与未移植HL-MSCs的耳蜗相比，在哇巴因处理的小鼠耳蜗中检测到了更多的HCs，并且HL-MSCs移植3个月后，ABR听力明显改善。最终得出结论：HL-MSCS可作为治疗SNHL的细胞疗法。以上实验结果表明，干细胞疗法对SNHL患者具有一定的治疗潜能。

2 基因治疗SNHL

2.1 基因疗法的研究背景

基因治疗的历史始于20世纪60年代末和70年代初，当时基因标记细胞被用于了解几种病毒载体的细胞转化机制。随着重组DNA技术和基因克隆的引进和进展，基因治疗在医学的许多领域得到应用，从神经细胞再生到抗癌治疗，基因疗法被用于治疗阿尔茨海默病[16]、胰腺癌[17]、肌肉疾病[18]和眼部疾病[19-20]。与此同时，耳聋基因治疗在短期内也取得了令人瞩目的成绩。

2.2 基因治疗SNHL的研究现状

基因治疗是利用分子生物学技术将目的基因导入人体内治疗相关疾病的方法。在基因治疗SNHL中，研究人员需要识别在毛细胞和听神经中可以再生的基因，然后选择合适的载体（比如病毒载体、纳米载体），将基因携带到靶细胞中。耳蜗基因治疗类似于干细胞替换听觉系统中丢失的HCs，使用载体将治疗基因(比如神经营养相关因子、Atoh1基因、Vglut3、miRNAs等)导入到患者的内耳，通过替换丢失的HCs及SGNs来恢复听力。内耳独特的解剖结构可使其作为基因治疗的一个理想的靶位。

耳蜗HCs的分化是由特异的基因调控的,其中最关键的是碱性螺旋-环-螺旋(basic helic-loop-helix,bHLH)基因转录调控因子,例如Atoh1是HCs分化的正向调控基因,Hes1和Hes5是负向调控基因[21]。目前，基因治疗在动物实验模型中取得了一定的成果。Lee[22]等人发现Math1基因是一种转录因子，对耳蜗corti器中HCs结构和功能的恢复起重要作用。在小鼠模型中，Chen[23，24]等人发现神经营养素-3（Neurotrophin-3，N-3）基因可以保护听觉神经和毛细胞免受顺铂的耳毒性作用。随后，Kawamoto等人[25]发现了一种基于载体的神经营养因子通过转基因表达，可防止毛细胞退化凋亡。Wise等人发现外源性载体介导的神经营养因子（BDNF）或N-3的转基因表达可延长听神经元的存活时间[26]。此外，Shibata等人[27]发现神经营养因子或神经营养素可以保护内耳毛细胞，增加听神经元的存活时间，并诱导听神经再生。Kelly等人[28]发现Atoh1基因对听觉功能起很重要的作用，他们通过敲除小鼠Atoh1基因建立小鼠先天性SNHL实验模型，然后将Atoh1基因克隆到一个载体中，并将其送回该小鼠体耳内，最终得出Atoh1的转基因表达可将支持细胞转化为与内源性感觉上皮相似的异位感觉细胞。最近，科学家发现miRNAs对内耳HCs的进化和生存起着关键作用，例如，去除大鼠和斑马鱼内耳中的miRNA会导致HCs死亡[29]。另一项研究结果表明，在脊椎动物的内耳中，miRNA对HCs的产生和维持其特征是必不可少的[30]。Akil等人通过敲除小鼠囊泡谷氨酸转运体-3基因（Vglut3），人为的造成小鼠SNHL，发现小鼠ABR阈值约为90dB，无惊吓反应，然后通过转基因表达的方式将Vglut3基因置入小鼠耳内，2周后小鼠ABR阈值恢复正常，惊吓反应部分恢复[31]。

以上动物实验研究表明，通过基因治疗能够成功地恢复听力功能，虽然这一技术没有运用到人类耳蜗，但这将是人类耳聋基因治疗的重要一步。

3 基因与干细胞治疗SNHL的局限性

3.1 干细胞治疗SNHL的局限性

使用干细胞再生来恢复听力的讨论和研究截至目前已有40余年的时间，得到广泛认同的一种观点是,干细胞疗法将有可能在HCs和SGNs严重退化或缺损时成为SNHL一个更直接更有前途的治疗方法，但这一技术的应用也存在诸多问题，如安全性、有效性、费用等方面问题。

例如，干细胞很难在内耳中存活，根据动物实验可以得知，即使目前的技术能够实现将转化的干细胞移植到内耳中，替换缺失的HCs和SGNs，它们对健康的负面影响可能难以控制，比如干细胞过度增殖、不可控制的分裂、难以精准的靶向等等，这些副作用会引起过度免疫、移植失败和免疫排斥等[32]。此外，耳蜗具有非常复杂的结构，包含许多不同类型的细胞，这些细胞从顶部到底部的差异很大，它们具有不同的功能，耳聋患者的病变部位可能不同，因此，能否将干细胞移植到耳蜗靶区也具有很大的挑战性。另外，干细胞在耳蜗组织中的植入可能存在一个有效的时机，过早或太迟也许都难以确保干细胞的有效植入，原因是在耳蜗组织结构没有发生损害的情况下，组织细胞间的连接十分紧密使之成为一道有效的组织细胞屏障，在这种情况下，外来干细胞几乎没有植入的可能；当然在损害修复之后形成的瘢痕组织同样形成一道有效屏障以确保内淋巴与外淋巴的有效隔离，在这种情况下，干细胞植入也十分困难，因为那里已经不再有缝隙供干细胞植入。在感觉上皮的损害过程中，组织细胞间的屏障遭到部分破坏或严重破坏，甚至形成百孔千疮，在这种组织急需修复的情况下，干细胞植入可能更容易，但这一说法还需要进一步的实验证实[33]。再者，费用昂贵同样阻碍了其应用。基于干细胞治疗SNHL未进行严格的临床试验，安全性与有效性均不明朗，且花费高昂，目前仅限于动物实验阶段，并没有应用于人类实验。

3.2 基因治疗SNHL的局限性

虽然基因治疗SNHL在动物模型中取得了许多可喜的成绩,但是也存在一系列远未解决的问题,离临床实际应用尚有很长一段的距离。现阶段基因治疗仅限于动物新生阶段干预，首要原因是缺少安全有效的手术径路，将目的基因输送到内耳的方法与干细胞移植相似，包括鼓阶途径、圆窗膜路径、半规管途径、蜗轴途径、耳蜗外侧壁等途径植入[34]，耳蜗空间小在一定程度上增加了手术难度，且在移植过程中多少都会对耳蜗本身结构造成损伤，再加上耳蜗中存在阻碍植入组织插入皮质器官的紧密连接，因此手术路径的选择研究也是能否成功的关键，目前还没有达成一致协议[35]。另外，基因转染的实现首先需要载体的携带，而载体能否将携带的特定基因片段转入到特定的耳蜗靶细胞，却是一个非常复杂的问题。

除此之外，基因治疗SNHL还可能存在以下局限性：（1）障碍大：基因治疗必须克服与内耳结构特征和解剖有关的几个障碍，耳蜗是一个被骨覆盖的封闭的充满液体的腔，很容易受到内耳液体数量和成分变化的影响。因此，在不破坏体内平衡的情况下，将基因输送到耳蜗靶区是非常具有挑战性的。（2）免疫反应：目前基因载体多选用病毒载体，但由于病毒载体可能引起部分病毒蛋白的表达，具有一定的免疫源性，可能激活内耳的免疫反应，从而导致基因表达的封闭[36]。（3）转染效率低：基因载体的选择是另一大难题，相对于病毒载体而言，非病毒载体的安全性较高，非病毒载体的主要缺点是转染效率较低和缺乏靶向性[37]。（4）费用高：纳米载体[38]如羟基磷灰石纳米颗粒（NHAT）在耳聋基因治疗中具有良好的生物相容性、几乎没有细胞毒性、无免疫性、无致癌性和相对无限的载量等优点。同时，这种粒子可用于连接不同的分子群，从而能够构建多种具有多功能的载体，虽然这些优点解决了病毒载体在耳聋基因治疗中的一些缺点，特别是在免疫源性和致癌性方面，但因其低转染效率（＜30%）、费用高同样阻碍了临床的应用。（5）未发现的副作用：基因一旦在内耳中启动表达，无组织特异性，可能会在内耳组织中广泛表达，如果不能对目的基因进行适当的控制和优化，引起不必要的细胞生长，可能会引起目前尚未发现的副作用[36]。

如果上述问题能够得到解决，我们有理由相信在不远的将来基因治疗将成为治疗感音神经性耳聋的有效方法。

4 总结与展望

干细胞疗法是用具有适当特征的新细胞群替换受损或缺失的HCs或SNGs的一种选择，这一治疗方法可能为SNHL患者提供一种新的治疗方法。基因治疗可用于将基因导入耳蜗病变部位，以诱导治疗剂基因的表达，取代缺陷基因或使支持细胞获得丢失或受损HCs的表型，以修复或再生受损SNGs。这两者都是现代医学先进的技术,给SNHL患者的治疗带来了新的曙光。但是基因与干细胞对SNHL的治疗面临诸多的难题有待突破。尽管面临诸多挑战，但基因和干细胞疗法在听力损失研究中仍然是一个诱人的策略，因为这可能是导致成熟哺乳动物耳蜗中HCs再生和SGNs恢复的唯一选择。动物研究的一些结果虽然没有在人类身上得到证实，但将动物研究的结果翻译到临床上并非不可能，有时也非常成功。现有的动物模型通过基因治疗和干细胞移植均成功地恢复了听觉功能。鉴于遗传学和细胞生物学的最新进展以及克服当前障碍的方法，我们相信基因与干细胞治疗SNHL的临床应用的最终目标并不遥远。当然，在实际临床应用之前仍需要大量的研究。