ceRNA调控网络在动脉粥样硬化中的研究进展

刘家汝， 王超，关秀茹

动脉粥样硬化（AS）是一种以血管内皮损伤为始点，伴随着炎症、免疫反应以及脂质浸润等多过程的综合性病变[1]。损伤血管壁以及引起炎症反应是吸烟、高脂血症等因素诱发动脉粥样硬化的主要原因，表现为血管内皮细胞和平滑肌细胞的凋亡、坏死、巨噬细胞分化等。因此，寻找动脉粥样硬化的新型分子标志物是我们的研究重点。

高通量转录组测序分析表明，非编码RNA（ncRNA）约占人类基因组的70%以上[2]。ncRNA包括小干扰RNAs（siRNAs），微小RNAs（miRNAs）和长链非编码RNAs（lncRNAs）等[3]。其中，miRNAs作为一种长度约为21～23个核苷酸的非编码单链小RNA已被证实普遍活跃在多种疾病的形成中[4]。这是因为miRNAs可结合mRNAs互补序列的3′UTR调节转录后的基因表达，通过阻断mRNA翻译和加速mRNA降解来降低蛋白质表达[5]，不断改变细胞或组织的生理功能。另外，一直被视为“垃圾”的长链非编码RNA—lncRNAs，近年来被发现可以弥合核酸和蛋白质间的间隙，成为蛋白质复合物转录和翻译的完整支架[6]，在肝胆、心血管、肾脏等多种疾病中发挥作用。此外，环形RNAs（circRNAs）是一种没有3′和5′末端的共价闭合环状非编码RNA，更是心血管系统疾病、糖尿病和肿瘤等一系列领域的研究热点[7]。

2011年Pier Paolo Pandolfi等首次提出了“ceRNA假说”，即细胞内存在竞争性内源RNA（ceRNA），这些ceRNA分子（lncRNA、circRNA、mRNA等）通过竞争miRNA的结合位点（MRE，又称miRNA应答元件）来影响miRNA功能和相关的mRNA表达，发挥其生物学作用，这种竞争性结合miRNA的作用称为miRNA“海绵”作用，该机制又被描述为细胞内前馈调控回路[8,9]。大量前沿研究表明，非编码RNA（ncRNA）广泛参与调控动脉粥样硬化发生的各个阶段。本文就ceRNA调控网络的特征及近年来其与动脉粥样硬化的相关研究进行综述。

1 ceRNA调控网络在动脉粥样硬化中对内皮细胞的作用

血管内皮细胞是血液和所有组织间的重要界面。当动脉血管受到多种因素，如炎性细胞因子、氧化应激、高血压和高血糖时，内皮细胞将维持血管稳态，发挥“屏障”作用[10]。同样，内皮细胞活性和功能衰退是诱发动脉粥样硬化的条件之一，在此过程中ceRNA调控网络扮演着不可替代的角色。

1.1 ceRNA调控网络参与调节内皮细胞增殖与凋亡lncRNA MALAT1作为ceRNA与miR-22-3p竞争，上调其靶基因CXCR2和AKT的表达，保护内皮细胞，避免ox-LDL诱导内皮损伤及其功能障碍[11]。另有研究表明，敲除脐静脉内皮细胞MALAT1促进miR-320a水平升高，miR-320a可直接靶向并抑制脐静脉内皮细胞FOXM1表达，抑制内皮细胞增殖[12]。MIAT作为ceRNA螯合miR-150-5p后减轻其对VEGF表达的抑制作用，竞争性调节内皮细胞的增殖、迁移和存活[13]。Shan等[14]研究发现lncRNA RNCR3在小鼠和人主动脉粥样硬化病变中的表达明显上调，并且敲除RNCR3将抑制体外内皮细胞增殖、迁移和加速细胞凋亡。通过进一步研究发现，RNCR3作为ceRNA通过RNCR3/miR-185-5p/KLF2网络调控途径参与调节动脉内皮细胞的功能损伤，防止血管内皮损伤。Wu等[15]认为，TNF-α可有效刺激内皮细胞MEG3水平升高，后者在一定程度上抑制miR-21表达调节内皮细胞增殖以及I型胶原、V型胶原和蛋白多糖的生成，与早期粥样斑块的形成有关。同时，Ming等[16]发现lncRNA SIRT1 AS/miR-22/SIRT1轴与血管内皮祖细胞向内皮细胞衍生过程密切相关。

此外，ceRNA也普遍作用于血管内皮细胞凋亡的不同环节。高表达lncRNA TUG1可去除丹参酮对ox-LDL所诱导的动脉粥样硬化ApoE-/-小鼠内皮细胞凋亡的逆转作用，这一过程通过TUG1/miR-26轴实现[17]。来源于线粒体的lncRNA—ASncmtRNA-2则有效延缓G2/M期细胞周期阻滞的复制衰老，这可能与miR-4485和miR-1973有关[18]。Lu等[19]发现lncRNA LOC100129973作用于miR-4707-5p和miR-4767，上调抑制血管内皮细胞凋亡的基因—API5和BCL2L12，辅助维持内皮细胞功能稳定。相反，lncRNA LINC00305作为miR-136的“分子海绵”，正向调控缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡[20]。

1.2 ceRNA调控网络与内皮细胞自噬自噬是一种细胞自我清除、纠正的方式，依赖于双膜自噬体降解长寿蛋白、错误折叠蛋白、过量或有缺陷的细胞器。研究发现，自噬不仅能降解大分子物质和细胞器来保护细胞存活，而且通过自噬作用介导细胞发生自噬性细胞死亡，促进胆固醇外流、减少细胞凋亡、干预胞葬作用并减弱炎症信号，负向调节动脉粥样硬化过程[21,22]。自噬与动脉粥样硬化之间复杂而微妙联系早已不足为奇，但ceRNA对细胞自噬的详细调控机制尚未明确。

Huang等[23]证明CERS1（神经酰胺合成酶1）、NAT8L（神经酰胺合成酶1）和LARP1（La核糖核蛋白结构域家族成员1）分别是调节动脉粥样硬化发展过程中自噬和炎症反应的关键蛋白：CERS1和NAT8L介导线粒体功能紊乱改变自噬水平；LARP1表达水平升高将促进SQSTM 1/p62的表达,活化NFKB RELA、CASP1，刺激VECs中IL-6、IL-8和IL-1β的产生。该研究还表明，TFGB2-OT1通过作用于CERS1、NAT8以及LARP1三个不同的靶点结合miR-3960、miR-4488和miR-4459，参与血管内皮细胞自噬及炎症反应。Ge等[24]发现，lncRNA FLJ11812作为miR-4459的“分子海绵”靶向调节ATG13的表达间接影响内皮细胞自噬。由此可见，TGFB2-OT1和lncRNA FLJ11812可为动脉粥样硬化的预防和治疗提供新的方向。

2 ceRNA调控网络在动脉粥样硬化中对平滑肌细胞的作用

平滑肌细胞的增殖、迁移和凋亡会显著影响泡沫细胞和纤维斑块的形成以及氧化应激等过程。在血管平滑肌细胞中，ceRNA网络将覆盖其增殖、死亡等多个过程并以多种方式改变动脉血管的状态。

2.1 ceRNA调控网络参与调节平滑肌细胞增殖与凋亡Wnt1是Wnt家族成员，Wnt信号已被证明是介导AS发展的重要调控通路[25]。Wnt1是miR148b的作用靶点，lncRNA H19可作为miR-148b的ceRNA来增强HA-VSMCs（人主动脉平滑肌细胞）中靶基因WNT1的表达，进而通过活化Wnt/β-联蛋白信号通路发挥促进血管平滑肌细胞增殖、迁移及抑制细胞凋亡的作用。同时Zhang等[26]敲除lncRNA H19后发现该信号通路被阻断。由此看来H19极具有预防AS的潜在应用价值。血管中膜平滑肌细胞中含有一种与动脉粥样硬化发展相关的lncRNA—APPAT，Meng等[27]发现，经ox-LDL刺激的VSMCs中APPAT的表达水平较低，而其靶基因miR-647的表达水平较高。进一步研究发现，APPAT与靶向miR-647的相反表达趋势可能是由于ceRNA的调节，最终导致其在组织和循环血液中表达相应的变化。微阵列数据生物信息学分析表明，胰腺纤维化过程中SXT12作为miR-148a的ceRNA，抑制miR-148a对SAMD5的影响，加速α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）分泌[28]，后者在平滑肌细胞增殖、凋亡以及粥样斑块形成和发展中起调节作用。除了lncRNA，circRNA也可扮演ceRNA的“角色”。高糖诱导的血管平滑肌细胞中circRNA WDR77明显升高，circWDR77通过靶向miR-124/FGF-2调控血管平滑肌细胞的增殖和迁移。

2.2 ceRNA调控网络与平滑肌细胞自噬血管重塑过程中平滑肌细胞的异常去分化、表型转换及其后续增殖会导致多种血管疾病，包括动脉粥样硬化、支架内再狭窄、术后移植血管病变等。自噬相关基因在血管平滑肌细胞中的高表达有助于维持平滑肌细胞静止和分化状态的平衡，防止平滑肌细胞异常去分化。Song等[29]证明MALAT1作为miR142-3p的分子诱饵或“海绵”，调节ATG7的表达，激活自噬，诱导血管平滑肌细胞向增殖表型转变。

3 ceRNA调控网络在动脉粥样硬化中对巨噬细胞和炎症反应的作用

动脉粥样硬化早期，巨噬细胞可通过清道夫受体无限摄入ox-LDL，使得ox-LDL过度沉积于巨噬细胞中，形成特征性的泡沫细胞和脂纹，最终发展成为粥样斑块[30,31]。此外，动脉粥样硬化伴随大量炎症因子的释放，而在其庞大的炎症反应体系中miRNAs的影响似乎无处不在。

Hu等[32]分析发现RP5-833A20.1位于NFIA的内含子区域与NFIA转录方向相反。经过miR-382介导，lncRNA RP5-833A20.1负性调控NFIA翻译过程，增加TNF、IL-1β和IL-6炎性细胞因子表达，降低胆固醇外流。另有研究证实，转录因子PU.1调控lncRNA lnc-MC与miR-199a-5p的结合，高表达下游靶基因ACVR1B，促进单核细胞向巨噬细胞的分化[33]。Ye等[34]认为高表达GAS5诱导促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α以及巨噬细胞MMPs释放。在ceRNA调控网络中GAS5可竞争miR-221，增强炎症反应，并于动脉粥样硬化后期加速纤维帽降解，加剧粥样斑块的不稳定性。在lnc-MKI67IP-3、let-7e和lκBβ所组构成的ceRNA干扰系统的调控下，let-7e反馈性降低lnc-MKI67IP-3的表达，导致炎症反应加重[35]。

4 前景与展望

迄今为止共有19 667个基因被称为蛋白质编码基因，其中约17 470个在蛋白质水平上已被证实，其余98%的人类基因组中相当一部分可转录成“非编码RNA”（ncRNA）[36]。其中miRNA高度保守的非编码 RNA分子在心血管疾病炎症和代谢方面的作用已被发现。存在于各种特异性组织或细胞中的miRNAs，如VCAM-1、miR-155、miR-181、miR-424、miR-223等，表达水平的高低将直接或间接影响血管炎症以及细胞代谢过程[37]。然而，由于miRNAs的多靶点作用机制及动脉粥样硬化各阶段病理性改变的复杂性，miRNAs可以通过多种分子或通路影响动脉粥样硬化发生，因此许多未知机制仍需深入探究。

lncRNAs（长度大于200个核苷酸的ncRNAs）在人类细胞中的表达水平通常较低，但组织特异性较高，转录过程也更为严格[38]。迄今为止，数以千计已知的lncRNAs已被报道。lncRNAs被公认为是一类高度通用的细胞功能调节器，且不受管制的lncRNAs表达可能存在于氧化应激、物质代谢异常、炎症反应等过程。但是，想要全面探究lncRNAs功能的有效性就不能局限于体外实验，有关lncRNA在动脉粥样硬化中的许多结论仍需在动物体内或临床水平加以证实。

大量证据表明，各种类型的RNAs可以在不同生理和病理状态下充当ceRNA发挥作用，包括假基因、lncRNAs、circRNAs和mRNAs等[39]。ceRNA调控网络具有多样性，同一lncRNA在不同的组织和细胞中与不同的miRNA竞争所产生的生物效应也不尽相同。例如，MALAT1/miR142-3p/ATG7机制诱导平滑肌细胞表型转换；而在内皮细胞中MALAT1又可与miR-320a竞争上调FOXM1水平，参与调控内皮细胞增殖。目前关于ceRNA调控网络的研究仍无法清楚的确定lncRNA和靶基因在动脉粥样硬化中的表观遗传作用和异常状态。因此，在未来的研究中需进一步扩大对ceRNA调控网络的认识，提升对动脉粥样硬化研究的高度[40]。