男性肿瘤患者生育力保存的研究进展

邵帅，王开秀，丁涛，姜经航，王婷婷，刘波，江梅*

(湖北省荆门市第二人民医院1.生殖医学科；2.泌尿外科，荆门 448000)

近年来，随着人们生活方式的改变，环境污染、食品安全以及手机辐射等对人类健康构成极大威胁，导致肿瘤发病率逐年升高，而且肿瘤患者也逐渐年轻化。研究显示仅在美国，每年就有7万多名年龄在15岁至39岁之间的青少年和青年患者被诊断癌症，15岁以下儿童的癌症发病率大约为每年1万例[1]。虽然肿瘤患者人数增多，但由于肿瘤治疗技术的提升，青少年肿瘤患者的生存率日益提高，大约80%患者可以长期生存[2]。在美国每450名男性中就有1人是肿瘤幸存者，但是却面临着肿瘤治疗导致不育的风险[3]。随着各种治疗方案的不断改进以及相关药物升级换代，肿瘤患者的致死率降低，生存期延长，但相关治疗以及肿瘤本身对生育力有着极大的影响。因此，患者治疗后对生育的需求正成为关注的热点，而肿瘤患者生育力保障的最佳时期是在开始治疗前尝试保留生育力，同时不影响患者的治疗。美国临床肿瘤学会和欧洲肿瘤医学会的指南均强调了肿瘤患者治疗前尝试保留生育力[4-5]。鉴于男性肿瘤患者尤其是青少年肿瘤患者的生育力问题的重要性以及迫切性，本文就肿瘤对男性生育力的影响以及男性肿瘤患者生育力保存方法做一综述。

一、肿瘤及治疗对男性生育力的影响

1.肿瘤对男性生育力的影响：肿瘤本身会影响男性生育力，导致男性少弱精子症，甚至无精子症。睾丸肿瘤和一些免疫或血液系统肿瘤(如白血病、淋巴瘤)都被认为是导致精液质量下降的重要危险因素。研究发现霍奇金淋巴瘤、白血病等能损伤男性生育力，导致精液量及精子浓度显著下降[6]。肿瘤的生长会侵袭正常的睾丸组织，影响睾丸生精功能，其机制可能与下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)控制睾丸功能有关，HPG调控正常精子生成所需的激素LH和FSH。泌乳素瘤产生的过多泌乳素、肿瘤多种症状或头颈部恶性肿瘤均会破坏HPG轴或导致性功能障碍[7]。肿瘤既能对睾丸产生直接影响，也可通过低表达热休克蛋白A2(HSPA2)、Na/K-ATP酶睾丸特异性亚型(ATP1A4)、泛素-细胞色素c还原酶复合物核心蛋白2(UQCRC2)以及过表达血管紧张素转化酶(ACE)间接影响睾丸的功能[8]。肿瘤也会激活全身细胞因子介导的炎症反应导致发烧，引发核心体和睾丸温度的波动，进而影响精子发生。而且肿瘤相关的情绪压力会导致各种激素水平的改变，如儿茶酚胺、泌乳激素、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)等，这些变化也可能对精子发生和精子功能产生有害影响。再者，肿瘤患者往往会出现长期的饮食方式改变及身体消耗增加，这将会导致营养不良，维生素、矿物质和微量元素的缺乏能够引发精子发生障碍[9]。最近的一项研究表明单侧睾丸肿瘤不仅损伤本侧睾丸功能，影响精子形成，甚至影响对侧睾丸的精子发生，睾丸肿瘤患者在治疗前精子浓度和精子活力均较低[10]。睾丸肿瘤相关的因子，如β-人绒毛膜促性腺激素(β-hCG)和甲胎蛋白(AFP)可能通过破坏HPG轴降低促性腺激素的生成而产生全身性影响以及通过影响睾丸精子发生而产生局部影响[11]。除此之外，睾丸肿瘤也可以通过破坏血-睾屏障导致免疫系统直接损伤精原干细胞以及影响局部免疫，并产生抗精子抗体。抗精子抗体能够影响精子的活力和获能，抑制精子的顶体活性，导致顶体反应受限影响精子穿透卵细胞放射冠，进而干扰精卵的结合受精，从而引发男性免疫性不育[12]。

2.肿瘤治疗对男性生育力的影响：手术、化疗和放疗是治疗肿瘤的主要方式，三者的联合应用使得肿瘤治疗效果极大地改善。但每一种治疗都可能会因HPG轴紊乱或者生精细胞毒性作用或者手术损伤等原因造成男性生育能力损害[13]。

睾丸切除术对生殖潜能有着直接的影响，单侧睾丸切除可导致85%患者的精子浓度和精子总数降低，9%患者出现无精子症[14]。经腹股沟途径根治性睾丸切除术是睾丸肿瘤的主要手术治疗方式，术中容易造成神经、血管、器官等损伤，而这些损伤均可导致性功能障碍。Wiechno等[15]最近研究显示经腹股沟途径根治性单侧睾丸切除术，术后短时间内睾酮水平不受影响，但术后1个月泌乳素显著降低，随后睾酮水平下降、性腺功能减退，导致勃起功能障碍(ED)。睾丸肿瘤中绝大多数是生殖细胞肿瘤，临床Ⅰ期睾丸非精原细胞瘤约占生殖细胞肿瘤的60%，而非精原细胞瘤常见腹膜后淋巴结转移，因此，术中建议行腹膜后淋巴结清扫术(RPLND)。既往RPLND容易损伤腹下神经及盆腔神经丛，术后患者都会出现逆行射精、ED、不育等并发症。为减少和避免并发症的发生，术中需要尽量避免损伤神经，使大部分患者有射精功能，但仍然还有一部分患者会出现ED和逆行射精等并发症[16]。

化疗对男性生育能力的影响很大程度上取决于所用的药物、剂量、疗程和组合。化疗药物中烷基化剂生殖毒性最大，治疗5年后大约25%的男性出现无精子症，青春期前患者使用环磷酰胺的剂量为7.5～9.0 g/m2容易导致婚后不育，青春期后患者使用环磷酰胺剂量为10.0 g/m2(300 mg/kg)容易导致不育，剂量为19 g/m2时容易导致无精子症[17]。临床常用的铂类化疗药也有相当大的生殖毒性，研究表明，使用铂类化疗药5年后，铂类化疗药低剂量组和高剂量组的无精子症发生率分别为20%和47%[18]。联合化疗方案作为一些恶性肿瘤的最佳选择，MOPP (甲氯雷他明，长春新碱，丙嗪，强的松)对血液系统恶性肿瘤有良好的效果，但85%的患者出现无精子症、性腺功能减退症并持续15年之久[19]。

放射治疗(XRT)可以直接作用于睾丸，也可以作用于腹膜后或骨盆肿瘤，通过产生大量的辐射损伤睾丸并导致性腺毒性。睾丸生殖细胞和体细胞的DNA损伤程度取决于放射野的大小、剂量及放疗方案。与化疗类似，快速分裂的精母细胞对辐射是最敏感的，也是最早受到辐射影响，低至0.1 Gy辐射剂量都会影响精子发生；0.35 Gy辐射剂量可造成可逆性短期无精子症；2～3 Gy辐射剂量可能造成长期影响，但有恢复的潜力；超过6 Gy辐射剂量可引起精原干细胞的完全耗竭和永久性不育[20]。

二、男性肿瘤患者生育力保存方法

1.自体精液冷冻保存：精液冷冻保存技术于20世纪60年代开始应用于辅助生殖技术中，是目前肿瘤患者生育力保存最成熟的技术。最新的美国临床肿瘤学协会指南也建议肿瘤治疗前进行精液冷冻保存。射精获得精液进行冷冻保存是一种安全、无创和首选的男性生育力保存方法，手淫是最佳的取精方式。将取出的精液缓慢加入到冷冻保护剂中，通过程序化冷冻或玻璃化冷冻放入到液氮中进行冷冻保存，精液冷冻复苏后根据精液情况进行人工授精(IUI)、体外受精-胚胎移植(IVF-ET)或者卵胞浆内单精子注射技术(ICSI)等，适用于青春期后的肿瘤患者。从生物学的角度来看，精子可以无限期地储存或者至少可以保存20年以上。研究显示精子在液氮中储存28年后，解冻后仍能保持良好的活力，而且能够与透明带正常结合[21]。两篇关于使用冷冻20年以上的人类精子进行受精的成功案例已经发表：1例是使用保存21年的精液进行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)已成功分娩[22]；另外1例使用储存了28年的精液进行人工授精(IUI)也已分娩[23]。一份研究报道是用冷冻了将近40年的精液进行试管受精，移植后顺利产下双胞胎[24]。Huang等[25]通过分析119 558份冷冻精液标本发现在人类精子库中长期冷冻储存精液不管通过IUI还是IVF-ET并不影响临床妊娠、流产或活产率，但超过5年的冷冻保存会影响精子的质量。主要是因为冷冻精液会降低精子活力，增加DNA碎片率，并增加活性氧的产生，冷冻前加入咖啡因和褪黑激素是一种非常有效和简单的提高精子质量的方法[26]。对于一些无精子症患者或因肿瘤导致的无精子症的患者，可以通过附睾穿刺精子抽吸术、睾丸穿刺精子抽吸术以及睾丸切开显微取精术等获得部分精子，避免耽误肿瘤治疗，取出的微量精子可以通过微量精子冷冻法，包括空透明带冷冻、玻璃化微滴冷冻、Cryopiece、Cell Sleeper法等，冷冻后再行ICSI受精。研究显示非梗阻性无精子症患者睾丸穿刺获取的睾丸精子冷冻复苏后行ICSI与新鲜睾丸精子相比，在受精率、卵裂率、优胚率、临床妊娠率、活产率等均无差异[27]。

2.睾丸组织冷冻保存：青春期前男性患者的睾丸组织尚未能形成成熟精子，以及青春期后无法提供精液样本的青少年和年轻人，可以通过取睾丸组织进行冷冻保存。睾丸组织的低温保存为恢复生育能力提供了几种选择：(1)当患者需要生育时，可解冻保存的睾丸组织，将睾丸组织移植到睾丸或异位区，在体内形成成熟的精子；(2)组织经酶消化后获得自体精原干细胞(SSCs)，然后再将SSCs移植到睾丸内形成精子；(3)体外培养睾丸组织，使精原干细胞经成熟分裂产生精子。但目前，这些方法仍处于实验阶段。

Fayomi 等[28]将青春期前雄性恒河猴睾丸组织冷冻保存后移植到恒河猴背皮或阴囊皮下，实验发现，8～12个月内移植睾丸组织生长并产生睾酮，并有精子形成，能够使恒河猴的卵母细胞受精、胚胎发育、怀孕，并且产下健康的雌性恒河猴。而在睾丸组织的异种移植中也被证明有精子生成，Ntemou 等[29]将青春期前的狨猴睾丸组织冷冻保存，解冻后异体移植到4周龄免疫缺陷小鼠的睾丸实质或背侧皮肤下，4个月后50%的睾丸内移植和21%的异位移植恢复睾丸功能，33%的睾丸内移植中观察到完整的精子发生，78%的睾丸内移植表现出减数分裂后的分化(圆形精子细胞、拉长的精子细胞和精子)，每条生精小管含精原细胞较多；移植后9个月，生精小管含有更多的减数分裂后生殖细胞，没有生殖细胞的小管较少。虽然睾丸组织移植已被证明是有效的恢复生育能力的技术，但这种技术对于患有全身性或转移性癌症的患者并不可行，因为残余的恶性细胞随时可能会传播。

对于接受过恶性肿瘤治疗的患者，可以通过消化组织、清除残余的恶性细胞或分离SSCs和移植最后的细胞悬液来恢复生育能力。Sadri-Ardekani等[30]在繁殖培养过程中通过几次传代获得了纯化的SSCs，但这些结果还有待证实。

睾丸组织的体外培养技术虽然受限，但也取得了长足的发展，很多研究都描述了使用青春期前小鼠睾丸组织的冷冻复苏后进行有机培养或3D培养分离细胞在体外完成精子形成的过程，而de Michele等[31]首次发现青春期前男孩睾丸组织冷冻保存，复苏后在体外进行的有机培养能够形成单倍体生殖细胞，并且减数分裂细胞和减数分裂后细胞在人体冷冻睾丸组织器官培养16 d后的发育。人类未成熟的睾丸组织在34℃血清替代品条件下，精原细胞和支持细胞的存活率最好。补充FSH/LH还可提高支持细胞的长期存活率和精原细胞在短期培养至减数分裂起始阶段的成熟[32]。

这些结果在动物模型中取得了很大的进展，但还需要进一步的验证和转化到人类研究中。此外，还需要进一步研究，以优化冷冻保存方案和策略，将肿瘤细胞重新引入冷冻保存的睾丸组织的风险降到最低。

3.干细胞在男性生育力保存中的应用：干细胞 (stem cells) 是一群具有自我复制能力的多潜能细胞，具有自我更新和多向分化能力，能够分化成多种功能的细胞。随着对干细胞不断深入研究，干细胞也逐渐应用男性生育力方面，并且多种干细胞可以诱导精子发生，包括精原干细胞(spermatagonial stem cells，SSCs)、间充质干细胞(mesenchymal stromal Cells，MSCs)、胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)。

精原干细胞(SSCs)是男性生殖的基础，其自我更新和分化的能力对男性生育能力至关重要，SSCs是唯一参与精子发生的干细胞。青春期前肿瘤患者在化疗前将SSCs从睾丸组织分离出来冷冻保存，需要的时候再将SSCs自体移植回患者睾丸内重启精子发生，使患者重新获得生育力，也可将SSCs分离出来进行体外培养形成精子。20多年前，Brinster等[33]第一个成功将SSC自体移植到小鼠体内，产生精子并产生后代。SSCs 数量极少，分离纯化的方式较为复杂，Tian 等[34]通过免疫细胞磁珠分离法和流式细胞术从模型小鼠睾丸组织中分离纯化了SSCs，将纯化后的SSCs移植到B细胞急性淋巴细胞白血病模型小鼠的曲精小管中，移植的SSCs在小鼠输精管基底广泛定植增殖，经过12周的SSC移植，受体睾丸组织中发现大量的生精细胞和精子。SSCs在体外可以通过饲养层细胞培养法、无饲养层细胞培养法、组织块培养法、三维细胞培养法等进行培养形成精子，Suyatno等[35]在SSCs培养液中添加血清替代物，体外可以培养2个月，并用多聚赖氨酸包被培养皿发现能抑制睾丸组织内其他体细胞的增殖；最近，Murdock等[36]发现人睾丸细胞外基质包被培养皿可以有效促进人SSCs体外增殖。

间充质干细胞(MSCs)代表一类成体干细胞，主要来源骨髓、脂肪、脐带血和组织等，也可以从包括睾丸在内的全身血管化组织中分离出侵袭性不同的MSCs[37]。2006年Nayernia等[38]人首次报道了MSCs在体外可向生殖细胞谱系分化，他们在小鼠骨髓间充质干细胞中诱导了减数分裂前期单倍体生殖细胞(GC)标记物的表达。人脐带来源的MSCs在体外培养条件下可产生支持细胞(SC)样细胞和单倍体生殖细胞(GC)样细胞，可以利用这些细胞的旁分泌特性来维持SSCs或促进它们在体外或体内的分化，用于生育力保存和修复[39]。SSCs移植被认为是最有希望保持肿瘤患者生育力的技术，但移植存活率很低，这可能是由于缺乏微环境，导致移植的SSCs凋亡。MSCs在提高SSCs移植效率以及促进精子形成方面有潜在益处。骨髓MSCs产生旁分泌因子，可能为骨髓MSCs的形成创造有利的环境并可能通过协助共移植的SSCs寻找支持位和启动分化来帮助内源性精子形成。因此，MSCs与SSCs联合移植在男性生殖功能恢复中具有广阔的应用前景。

胚胎干细胞(ESCs)经诱导可分化为三胚层的所有类型细胞，包括精子细胞，甚至形成活动的精子。人ESC体外诱导向精子分化的过程，再现了体内精子的发生，同理，若体外ESCs向精子分化发生异常，可提示体内精子发生障碍。Makoolati 等[40]将ESCs体外来源的SSCs移植到无精子症动物模型中，移植8周后观察到输精管基部和受体睾丸内的注射细胞、移植睾丸的精原细胞数和睾丸质量均高于对照组。成纤维细胞生长因子8(FGF8)的下调可以促进ESCs向SSCs的分化，且FGF8的表达水平与MAPK/ERK信号呈正相关，FGF8可以通过调节细胞分化和自我更新之间的动态平衡来调控生殖细胞的命运[41]。Nayernia等[42]利用小鼠ESCs 来源的SSCs进行减数分裂，在体外产生单倍体的雄配子，通过卵胞浆内单精子注射技术使小鼠卵母细胞受精，由此产生的双细胞胚胎被转移到输卵管中，出生的7只子代中有6只发育到成年期，表明通过这种方法从胚胎干细胞中获得的雄性配子能够诱导正常的受精和发育。

诱导多能干细胞(iPSCs)：在精子和SSCs缺乏情况下，人类iPSCs技术可以通过利用皮肤活检来源的成纤维细胞或其他非侵入性来源的细胞，如尿液来源的细胞或头发角质细胞等生成配子[43]。iPSCs可以从病人的体细胞中衍生出原始生殖样细胞(PGCs)用于睾丸移植，诱导体内生殖细胞发育；除此之外，在克氏综合征和非梗阻性无精子患者中已经衍生出iPSCs[44-45]。到目前为止，人类iPSC可分化为PGCs，且过表达DAZ 家族蛋白时，PGCs 可进入减数分裂阶段，并最终形成表达精子顶体酶的单倍体精子细胞[46]。在体外从小鼠ESC和iPSC中已经获得PGCs，移植到小鼠卵巢和睾丸后可以活产[47]。iPSC的出现使得生殖领域取得了极大的进展，也为男性生育力保存提供了极大的潜力。

总结

随着肿瘤治疗技术不断提高，肿瘤患者生存率不断提高，患者对于生育的需求越来越强烈，但肿瘤本身及其治疗都会直接或间接损伤睾丸，影响男性生育力导致不育。对于不同年龄段的肿瘤患者可以采取不同的生育保存方法，对于青春期后有生育需求的肿瘤患者，可以通过自体精液冷冻进行生育力保存；而对于青少年或者儿童肿瘤患者可以通过睾丸组织冷冻或者精原干细胞冷冻进行保存；而对于无精子症患者则可以通过干细胞技术获取生育力，虽然干细胞技术的研究目前处于起步阶段，还有很多潜在的风险，安全性和有效性有待研究，但毫无疑问干细胞在生殖医学领域中具有非常重要价值，并且具有广阔的临床应用前景。