EAPⅡ与癌症发生和发展的研究进展

癌症的形成是一个多因素作用、多基因参与、多阶段逐渐形成的复杂演进过程，其发生涉及到很多方面，包括基因的突变、细胞因子的表达变化以及信号转导通路的调节等[1]。EAP Ⅱ（ETS1-Associated Protein Ⅱ）参与多种信号转导途径，例如TNF-TNFr，TGF-β 和MAPK，EAP Ⅱ与免疫防御，炎症反应，病毒感染和 DNA 毒素（化学或放射疗法）有相互作用。近年来研究发现 EAP Ⅱ可上调致癌蛋白MYC 和cyclin D1 的表达，从而促进癌症的发生和发展[2]。本研究就致癌因子 EAP Ⅱ在癌症发生和发展中的作用机制作一综述。

1 EAPⅡ概述

EAPⅡ为一种 ETS1 相关蛋白，是参与肿瘤发生和转移的转录因子[3，4]，具有调节ETS1[5]的转录活性的作用。EAPⅡ也被确定为TTRAP（TRAF and TNF receptor-associated protein），即TRAF 和TNF 受体相关蛋白[6]。TTRAP 通过与CD40 的胞质结构域、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）受体75 和TNF 受体相关因子（TNF receptor-associated factors，TRAFs）结合，抑制NF-κB 活化[7]。近年来，EAP Ⅱ被认为是第一个去除拓扑异构酶介导的 5'-磷酸酪氨酰键上加合物的酶，称为TDP2（tyrosyl-DNA phosphodiesterase 2，酪氨酰-DNA 磷酸二酯酶2）[8]。TDP2可在双链断裂时恢复 5'-磷酸末端，在酵母中对拓扑异构酶 （ITop1）抑制剂喜树碱产生抗性的TDP2 的连接和过表达做准备[9]。目前的研究主要阐述了EAP Ⅱ在许多生物过程中的生理和病理作用，包括胚胎发育、神经元发育，癌症发展、进展和化学抗药性[10]。

2 EAPⅡ蛋白的结构和功能

EAP Ⅱ基因在黑猩猩、狗、牛、小鼠、大鼠、鸡、斑马鱼、软体动物和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中是保守的[11]。在人类中，EAP Ⅱ细胞遗传带位于6p22.3-p22.1[12]。七个EAP Ⅱ外显子分布在17 kb 基因组 DNA的反链上。在大多数检查的组织和细胞系中 EAP Ⅱ 基因的单个2.3 kb 转录子普遍表达，包括正常的人肾、肺、肝、胸腺、乳腺、卵巢和前列腺。EAP Ⅱ mRNA 编码362个氨基酸的蛋白质，以49kD 的表观分子量迁移。该蛋白质在大多数检查过的癌细胞系中均可检测到，EAP Ⅱ蛋白以43kD 迁移的一种变体形式也出现在许多癌细胞系中[13]。外源EAP Ⅱ的强制表达可产生两条以49kD 和43kD 迁移的条带。两种形式都可以被多种EAP Ⅱ抗体特异性识别，并且可以被针对EAP Ⅱ转录本的编码序列或非翻译区（UTR）的各种shRNA 击中。43kD 的EAP Ⅱ蛋白存在于哺乳动物细胞中。通过对EAP Ⅱ的蛋白质序列比对，EAP Ⅱ包含一个保守域，保留了所有六个基序，这些基序是核酸内切酶/核酸外切酶/磷酸酶超家族的标志[14]，这个庞大的蛋白质家族包括参与细胞内信号传导的镁依赖性核酸内切酶和磷酸酶（Exo_endo_phos）。在 Exo_endo_phos家族中，EAP Ⅱ与人类HAP1、REF-1、APE1 最相似，它是一种核酸内切酶，在DNA 修复过程中参与识别和切割嘌呤、嘧啶（AP）位点[15]。

3 EAPⅡ与相关信号传导通路

EAPⅡ被证实可通过CD40、TNFR-75 和TRAFs5等适配激活，参与多个信号传导通路并激活ETS1、ETS2 等因子[16]。到目前为止，已鉴定出20 多种与EAP Ⅱ相关的蛋白质。EAP Ⅱ相关蛋白网络主要牵涉两种生物学功能：转录调控和信号转导。EAP Ⅱ的主要配型包括Ets家族成员在内的转录因子ETS1、ETS2、FLI1、Smad3[17]。Ets家族参与调控一些重要的生理或病理过程，包括细胞增殖、分化、淋巴细胞发育、血管生成和肿瘤转移[18]。Smad3是一种受体调节的转录因子，可转导由TGFβ 激活的细胞外信号[19]。而TGFβ是一种多功能细胞因子，参与调节上皮细胞的存活/或凋亡、增殖、分化和上皮向间质转化[20]。EAP Ⅱ通过直接的蛋白结合抑制ETS1、Smad3 的反式激活[21]。EAP Ⅱ与Smad3的相互作用，可抑制斑马鱼胚胎发育中Snail1a 的表达而导致钙黏蛋白的抑制[22]。因此，EAP Ⅱ本身没有内在的转录活性，与Gal4DNA 结合域融合的EAP Ⅱ（GAL4-DBD-EAP Ⅱ）不会激活Gal4。但是EAP Ⅱ可以正调控或负调控其他转录因子的转录活性。此外，EAP Ⅱ还可能通过调节信号级联反应的上游来调节NF-κB 的转录活性，对AP-1 反式激活有类似抑制作用。因为ETS1 与AP-1或NF-κB 的相互作用广泛参与了组合转录的控制，抑制的机制可能是通过干扰ETS1 的转录活性而实现的[23]。另一方面，EAP Ⅱ关联所需的CD40 胞质域（230-245aa）与TRAFs 识别基序重叠。CD40配体处理可显著增加EAP Ⅱ-CD40 受体的结合，而EAP Ⅱ的过表达可抑制受体启动的NF-κB 反式激活。但对p65或IKKα 诱导的反式激活没有影响，表明EAP Ⅱ作用于信号级联反应的上游成分[24]。肿瘤坏死因子受体相关因子（tumour necrosis factor receptor-associated factors，TRAFs）是NF-κB信号通路中的关键调节蛋白。TRAFs 涉及细胞活化、分化，细胞存活和免疫反应，在这些信号传导途径之间的交叉效应中发挥重要作用[25]。而EAP Ⅱ与TRAFs 有相关性，对TRAF6 的亲和力最大[26]，提示EAP Ⅱ参与复杂的信号调节。Li 等[13]的研究发现，EAP Ⅱ参与肺癌细胞中MAPK-ERK 信号传导通路的调节。EAP Ⅱ过表达显著激活Raf-1 和ERK1/2，但并不激活JNK 和p38 传导通路。随后通过信号传导通路调节下游靶标MYC 和cyclinD1。这些结果表明，EAP Ⅱ通过解除EGFR 信号传导来促进肺癌的发展，这与NSCLC 的发展和进程有关[27]。Zucchelli 等[28]的研究显示，在神经母细胞瘤细胞中，EAP Ⅱ在野生型DJ-1 存在下会抑制JNK 活性。然而，与EAP Ⅱ强烈结合的突变体DJ-1 通过JNK 和p38MAPK 途径诱导了细胞死亡。因此，EAP Ⅱ可能充当打开或关闭特定信号通路的开关角色。

4 EAPⅡ与癌症

4.1 参与凋亡诱导的调节众所周知，回避细胞凋亡是癌症发展的特征之一。研究EAP Ⅱ在细胞凋亡中的作用有利于探索癌症的发展中EAP Ⅱ的作用机制。近几年的研究显示EAP Ⅱ可以细胞特异性方式保护细胞免于凋亡或促进细胞凋亡。有趣的是，不同研究中的癌症模型显示EAP Ⅱ的实验结果却大相径庭。EAP Ⅱ对细胞凋亡有抑制作用，如Zucchelli 等[28]报道了EAP Ⅱ保护神经母细胞瘤细胞免受蛋白酶体抑制剂MG132 诱导凋亡的实验结果。Li 等[13]研究中指出EAP Ⅱ受抑制可导致H460、H522 和H1975型肺癌细胞凋亡。另一方面，EAP Ⅱ在一些细胞系中却促进细胞凋亡作用。EAP Ⅱ可促进细胞毒性剂氢醌诱导的HL-60细胞凋亡[29]。Cao 等[30]指出癌基因与Ras 结合依赖于EAP Ⅱ的调控，通过JNK 和p38MAPK 信号通路从而促进细胞凋亡。此外，由FOXO3a 激活依赖于JNK 传导通路的TNF 受体信号，所引起的细胞凋亡过程中，EAP Ⅱ表达显著上调[31]。EAP Ⅱ对细胞凋亡的调控作用可能是由于EAP Ⅱ激活与之相互作用的蛋白以及相关的信号传导途径引起的。如TNF 和TGF-β，涉及促凋亡和（或）抗凋亡发生。这些过程涉及促凋亡和（或）抗凋亡，具体取决于特定通路级联的完整性以及信号级联中蛋白质的状态[32]。

4.2 在癌前病变和癌症早期的作用虽然在上述一些研究中，观察到了EAP Ⅱ在细胞凋亡中的不同作用，但EAP Ⅱ在癌症发展中的生物学意义仍然未知。EAP Ⅱ在癌症进展中的作用与其在细胞凋亡过程中有相似之处，即不同的癌症类型中EAP Ⅱ的表达增高或降低。Li 等[11]的研究显示，大多数非小细胞肺癌（NSCLC）患者的免疫组织化学实验结果，EAP Ⅱ蛋白显著升高（90%），并且EAP Ⅱ的表达水平和定位在肺癌发展过程中发生了变化。在高度增生的组织中细胞核染色可见EAP Ⅱ表达，大多数肺癌表现出细胞质或细胞质以及核染色。这一发现表明，EAP Ⅱ可能有助于促进肺癌在早期阶段的发展。在小鼠NSCLC 异种移植模型中，观察到了EAP Ⅱ表达显著增高，证实了其致癌作用[13]。该研究支持EAP Ⅱ是肺癌发展的致癌因素的观点。在Barrett 食管癌前病变的研究中[33]，伴随着正常的食管鳞状上皮演化为肠上皮化生的过程中，EAP Ⅱ表达也明显增加。Pyeon 等[34]的研究显示，宫颈癌和患有人乳头瘤病毒（HPV）感染的头颈癌患者中，EAP Ⅱ的表达上调。该研究也充分支持EAP Ⅱ促成癌症发病机理的观点。另一方面，在几种类型的癌症或癌前病变中，却均观察到EAP Ⅱ表达减少的现象。例如在一项原发性淋巴瘤细胞研究中，与非癌性T淋巴细胞和NK 淋巴细胞比较，原发性淋巴瘤细胞、原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤和霍奇金淋巴瘤的EAP Ⅱ表达均明显降低[35]。Galamb 等[36]在结直肠癌的研究中显示，与同一患者的正常组织相比，EAP Ⅱ在癌前腺瘤组织中表达下调。

4.3 在癌症进展期的作用EAP Ⅱ在一些癌症进展期的研究中，也观察到EAP Ⅱ表达的变化。在小鼠浸润性结肠癌细胞系（相对于非浸润性细胞系）和人转移性前列腺肿瘤（相对于原发性前列腺肿瘤）中发现EAP Ⅱ表达显著下降[35，37]。Vahteristo 等[38]通过血液来源的基因表达谱显示，多发性棘状细胞癌的干性色素性皮肤干燥综合征患者的EAP Ⅱ转录水平低于对照组。Li 等[13]的研究显示在NSCLC细胞中EAP Ⅱ的重新表达促进细胞增殖并增强异种移植肿瘤的生长，而使用shRNA 技术的EAP Ⅱ抑制实验则诱导了细胞凋亡并降低异种移植肿瘤的生长。使用抗体阵列的主要信号通路分析结果表明，EAP Ⅱ上调了致癌蛋白MYC 和cyclinD1。由此可见，EAP Ⅱ在这些模型中激活了细胞外信号调节激酶（ERK1/2），但未激活JNK或p38MAPK 途径，这表明EAP Ⅱ是Raf-ERK/MAPK 信号通路的上游因子，并且在癌症的发展中具有致癌作用。

综上所述，EAP Ⅱ在细胞生物学的许多方面都发挥着重要作用，包括DNA 链烯的拓扑缠结、细胞对微环境的反应能力、细胞存活率和细胞迁移。这些功能涉及癌症发展的许多方面，包括染色体不稳定、肿瘤发生、肿瘤转移。特别是EAP Ⅱ介导的信号，包括免疫防御，炎症反应和细胞应激（如缺氧和DNA 毒性），是肿瘤微环境编排的关键因素。因此，作为ERK/MAPK 信号通路的上游因子，EAP Ⅱ参与癌症发生和发展多个环节。但目前EAP Ⅱ对癌症的作用机制研究尚不够深入，其在癌症方面的研究还有待于进一步探讨。