新型雌激素膜受体GPR30与子宫内膜容受性及卵母细胞成熟的关系

周丽媛，毛增辉

(湖南省妇幼保健院生殖中心，长沙 410007)

2002年，G-蛋白偶联受体30(G-protein coupled receptor 30，GPR30)被发现是除雌激素核受体(ERα和ERβ)外的一种G蛋白偶联七次跨膜受体[1-2]。作为一种新型的雌激素膜受体，GPR30从发现至今一直是研究的热点，其主要介导雌激素的快速非基因反应，如腺苷酸环化酶(cAMP)、内皮细胞一氧化氮合酶系统(eNOS)、环磷酸鸟苷(cGMP)和超氧化物歧化酶等信号转导通路的活化。随着GPR30在卵泡细胞中被发现，其与生殖领域的相关性逐渐被广泛关注。本文探讨GPR30与子宫内膜容受性及卵母细胞成熟这两个与辅助生殖助孕成功率密切相关的因素之间的关系。

一、GPR30的发现

雌激素有多种受体，包括众所周知的核受体(ERα和ERβ)及新型的膜受体GPR30。1997年在人MDA-MB-231乳腺癌细胞和人MCF7乳腺癌细胞中，利用差异cDNA文库筛选技术发现并克隆了GPR30的cDNA，但当时并没有发现GPR30是一种雌激素受体[1]。直到2002年，通过将GPR30质粒转染至人类乳腺癌细胞MDA-MB-231中，发现GPR30参与了雌激素介导的cAMP-表皮生长因子受体激活等快速作用，首次证实了GPR30是一种新型雌激素受体[2]。2004年研究者们发现GPR30的表达可以被其反义寡核苷酸序列阻滞，并证实了GPR30是G蛋白偶联七次跨膜受体家族中的一员[3]。

人类GPR30基因位于染色体7p22.3，该基因由3个外显子组成，GPR30氨基酸的编码区位于第3个外显子。GPR30由375个氨基酸组成，分子量约为40～50 KDa[4]。在GPR30发现后，其命名并不统一，直到2007年才确定了官方名称：G蛋白偶联雌激素受体-1(GPER1)，但目前广泛使用的名称依然是GPR30[5]。GPR30分布广泛，可表达于内质网、质膜和胞内小泡等膜结构[6]。

自从发现GPR30后，研究者们致力于研究这一新型雌激素受体的具体作用。研究发现雌激素的慢反应是由其经典的核受体(ERα及ERβ)介导的，通过调控相关基因转录、蛋白质翻译等基因反应进行，通常需要几小时的时间[7]；然而雌激素参与的许多快速非基因反应是由GPR30介导的，如cGMP、eNOS和超氧化物歧化酶等信号通路的活化[8-9]。短期使用雌激素能降低绝经后高血压妇女的外周血管阻力和血压，若长期使用雌激素能提高血管对血管舒张因子[如一氧化氮(NO)]的敏感性，雌激素的这些作用均与雌激素膜受体GPR30密切相关[10]。提示雌激素是通过膜受体GPR30，而非核受体(ERα及ERβ)，介导血管的舒张作用[10-11]。

二、GPR30与子宫内膜容受性

GPR30作为雌激素膜受体，主要介导雌激素的快速非基因作用，包括促进细胞增殖，降低细胞凋亡，促进血管生成、舒张血管、降低血管阻力等。GPR30广泛分布在乳腺、卵巢、子宫内膜、宫颈、滋养层细胞、胎盘血管、睾丸及前列腺等组织中[12-17]。但目前研究多集中于其与相关肿瘤发生的关系，如子宫内膜癌、乳腺癌、宫颈癌等。GPR30参与这些恶性肿瘤的发生，并与肿瘤预后密切相关[13-15]。其中子宫内膜癌患者GPR30的表达显著升高，GPR30通过PI3K/AKT等相关信号通路促进子宫内膜细胞增殖[13]。

随着研究的深入，GPR30特异性激动剂G1转基因动物被应用到对GPR30的研究中。之前在离体小动脉环的体外实验研究中表明，G1能够舒张猪的冠状动脉，小鼠的肠系膜动脉、主动脉和颈总动脉，人的乳腺动脉等[13]。GPR30的血管舒张作用比较复杂，我们之前在人脐静脉血管内皮细胞中的研究证实，GPR30与雌激素结合后，可促进血管内皮生长因子(VEGF)合成，从而促进血管生成；同时可通过PI3K/AKT通路调节血管扩张剂NO的合成，进而调节血管舒张[18-19]。NO可参与调节胎儿-胎盘血管反应性、降低胎盘床血管阻力、增强滋养层细胞浸润能力、降低滋养层细胞凋亡、降低绒毛间隙血小板粘附和聚集等，在促进胚胎存活、组织重塑、免疫抑制和对胎盘营养转运等方面发挥着重要的支持作用[20]。人子宫内膜中存在一氧化氮合酶(NOS)，其能在氧气存在的条件下，催化L-精氨酸分解生成NO和L-瓜氨酸，NO在促进胚胎着床过程中具有重要作用。有证据表明NO/NOS系统能够改变子宫内膜螺旋小动脉的形成与植入，促进子宫内膜的蜕膜化改变，在胚胎植入过程中可能起着重要的作用[21]。且我们之前在滋养层细胞体外实验研究中表明，GPR30激动剂能够增强滋养层细胞的增殖、侵袭等能力，促进胚胎植入[16，22]。因此，GPR30可能通过调节NO/NOS系统，从而舒张血管、降低小血管阻力，促进小血管生成、促进子宫内膜蜕膜化等，改善子宫内膜容受性；且GPR30可能通过增强滋养层细胞的侵袭能力，降低滋养细胞的凋亡，促进胚胎植入，继而改善妊娠结局。

GPR30参与了多种生殖系统事件，包括卵泡形成、子宫内膜细胞增殖、增加子宫对催产素的收缩反应、促进精子增殖、抑制精子凋亡等[16，22]。此外，与正常女性相比较，子宫内膜异位症患者、子宫腺肌症患者及多囊卵巢综合征(PCOS)患者子宫内膜上的GPR30表达均存在差异。研究表明与正常参与者的子宫内膜相比，子宫内膜异位症患者子宫内膜中GPR30表达量升高[23-24]。通过对正常女性及子宫腺肌症患者子宫组织GPR30的单核苷酸多态性(SNPs)进行分析，发现子宫腺肌病患者子宫组织的GPR30的SNPs表达不同，即GPR30的SNPs在子宫腺肌病组中，与子宫腺肌症疾病进展相关的rs4266553的C等位基因出现多态性更为常见，提示GPR30的基因多态性可能与子宫腺肌病发病相关[25]。研究者检测了PCOS患者及正常女性植入期子宫内膜中ERα、ERβ和GPR30的表达量，结果发现PCOS患者种植窗子宫内膜的GPR30表达较正常者显著下降，可能影响胚胎着床，相关分子机制研究尚未见报道[26]。子宫内膜异位症患者、子宫腺肌症患者及PCOS患者合并不孕的概率较高，且这些患者行辅助生殖助孕成功率及持续妊娠率都较正常女性低，但具体机制目前尚不明确。子宫内膜异位症患者、子宫腺肌症患者及PCOS患者中，子宫内膜GPR30的表达量不同或者基因多态性不同，可能降低这些患者的子宫内膜容受性，增加不孕症的发生并影响其辅助生殖助孕的结局，但具体机制需要进一步的研究证实。

三、GPR30与卵母细胞成熟

卵泡液是卵丘冠复合物、卵泡膜细胞和颗粒细胞增殖分化的微环境，卵母细胞的生长发育依赖卵泡液中的各种生长因子和激素，其中E2水平较为重要。研究表明HCG扳机日血清E2水平可能和卵子成熟、受精以及胚胎质量存在正相关的关系，虽然卵泡E2水平显著高于血清E2水平，但两者浓度呈正相关，因此外周血内E2的水平可以间接反映卵泡液E2的水平，外周血E2水平可以作为预测卵母细胞是否成熟的标志[27]。人们在研究鱼类卵母细胞与雌激素关系的实验中发现，体外培养液E2的浓度与卵母细胞内内源性cAMP含量呈正相关，而卵母细胞内高水平的内源性cAMP对维持卵母细胞减数分裂停滞是必须的；E2通过增加卵母细胞内内源性cAMP水平，从而抑制卵母细胞减数分裂及成熟[28-29]。而且有学者发现过高浓度的E2可能导致小鼠卵母细胞的凋亡[24]。这些足以说明卵泡液E2水平与卵母细胞成熟存在相关性。近期研究表明，E2是通过激活其膜受体GPR30刺激卵母细胞生成内源性cAMP并保持高水平的内源性cAMP，从而抑制卵母细胞的成熟和减数分裂[30]。卵母细胞与卵丘细胞通过长微绒毛紧密联系，长微绒毛横贯于卵母细胞与颗粒细胞之间，使卵丘细胞及卵母细胞间形成桥粒和缝隙连接，卵丘细胞通过这些连接参与卵母细胞的成熟[31]。之前认为雌激素在卵泡成熟过程中的作用很多由ERβ介导，因为有研究发现随着卵母细胞的不断成熟，卵泡液中的E2水平及卵丘细胞内雌激素核受体ERβ的表达量也随之升高，但这些研究结果都不足以阐释雌激素与卵母细胞发育与成熟的关系[32-33]。近期，研究者们通过使用GPR30的抑制剂或者进行siRNA基因沉默后，颗粒细胞的增殖显著降低，表明人类卵泡液内E2是通过GPR30受体，而非经典的核受体，介导颗粒细胞增殖的[30]。

从2006年研究者在鱼类性腺中发现GPR30开始[34]，雌激素通过GPR30参与卵子成熟的相关性研究引起了研究者们的兴趣。有研究者从黄鱼卵巢中克隆出了GPR30的cDNA，将GPR30的cDNA转染至黄鱼卵母细胞及HEK 293细胞，发现其稳定表达于细胞质膜上；注射E2或GPR30特异性激动剂G1到黄鱼和斑马鱼卵母细胞中，可显著降低卵母细胞的自然成熟；而GPR30的反义寡核苷酸可以阻断雌激素对卵母细胞成熟的抑制作用，说明GPR30在调节卵母细胞成熟中起着关键作用[35]。同时有学者发现GPR30的小干扰RNA通过阻断GPR30 mRNA和蛋白的表达，减少了仓鼠卵巢原始卵泡形成，说明GPR30是雌激素刺激卵巢原始卵泡形成中所必须的因子[36]。

2011年，Peyton等[37]在研究斑马鱼的卵母细胞成熟机制中发现，雌激素通过GPR30反式激活EGFR-MAPK信号通路，使MAPK磷酸化激活，进而抑制脊椎动物的卵母细胞减数分裂；且在一定的雌激素浓度范围内，卵母细胞减数分裂的抑制程度与雌激素水平呈正相关。另外，近期的研究已经清楚的说明，E2通过激活GPR30刺激卵母细胞生成cAMP并保持高水平的内源性cAMP，从而维持鱼类卵母细胞减数分裂停滞[30]。而排卵前LH峰激活孕激素膜受体，继而抑制G蛋白信号通路，降低卵母细胞内内源性cAMP水平，促进卵母细胞的减数分裂。提示排卵前LH峰通过降低鱼类卵母细胞内内源性cAMP，促进卵母细胞减数分裂；而GPR30通过增加内源性cAMP，维持鱼类卵母细胞减数分裂阻滞。但目前关于GPR30维持对卵母细胞减数分裂阻滞的具体调控机制尚未完全阐明。

在哺乳动物中，研究者们发现GPR30存在于小鼠卵母细胞内，通过检测小鼠不同阶段卵母细胞GPR30的表达水平发现：成熟卵母细胞中GPR30表达最高，而未成熟卵母细胞中GPR30表达较成熟卵母细胞低；并且体内成熟的卵母细胞较体外培养成熟的卵母细胞，GPR30表达量更高；目前体外成熟的卵母细胞的胚胎发育潜能低于体内成熟的卵母细胞，卵母细胞质膜GPR30的表达量与卵母细胞质量的相关性尚不明确，但推测小鼠卵母细胞GPR30的表达量与小鼠卵母细胞的成熟和卵母细胞质量存在相关性[38]。还有研究发现，在体外培养的山羊和小鼠卵冠丘复合体(COCs)中，卵丘细胞与卵母细胞上都存在GPR30的表达，且定位在细胞的质膜上，E2通过GPR30增加小鼠及山羊COCs中内源性cAMP水平及ERK1/2磷酸化水平，从而促进卵丘的扩展[39-40]。与鱼类一样，卵母细胞中高水平的内源性cAMP以及G蛋白的激活对维持哺乳动物卵母细胞减数分裂停滞是必须的；但是维持内源性cAMP高水平的具体机制尚不明确，推测可能与GPR30相关[41-42]。直到2019年，有研究表明E2可能通过GPR30介导山羊卵母细胞减数分裂的进行，且GPR30介导的卵母细胞减数分裂可能与山羊COCs缝隙连接通透性下降相关，而缝隙连接通透性下调可能是由GPR30-MAPK激酶依赖的CX43磷酸化介导的，其具体机制还需进一步证实[43]。总之，在哺乳动物(山羊及小鼠)生殖过程中，GPR30通过调节COCs缝隙连接通透性参与调节卵母细胞减数分裂，但其具体机制尚未阐明，需要进一步探索。

综上所述，新型雌激素膜受体GPR30介导雌激素的一些重要作用，目前关于GPR30对子宫内膜血管血流、子宫内膜容受性及卵母细胞成熟的具体调控机制尚处于探索阶段。深入研究GPR30可能为改善子宫内膜容受性及人类未成熟卵母细胞体外培养成熟的研究提供新的方向，进一步推进辅助生殖技术的发展。