花生油质蛋白基因的克隆与表达分析

徐 赫，潘丽娟，陈明娜，陈 娜，王 通，王 冕，禹山林，梁成伟，迟晓元*

(1.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 266042；2.山东省花生研究所，山东 青岛 266100)

花生是我国重要的油料作物[1]和经济作物[2]，广泛栽培于北方地区。花生油含不饱和脂肪酸80%以上(其中油酸41.2%，亚油酸37.6%)，还含有软脂酸、硬脂酸和花生酸等饱和脂肪酸，是一种较易消化的植物油，但油脂储藏过程发生酸败会使品质下降。令人欣喜的是近些年有研究发现[3]，油质蛋白有增强产品稳定性的作用。因此寻求优质油质蛋白基因，延长产品货架期，显得尤为重要。

油质蛋白是一种特殊的结构蛋白，在种子中存在且高效表达[4]。可作为外源蛋白的载体，将油质基因与目的基因融合后经转化获得转基因新型种子[5]，经过研磨、离心等处理后获得目的基因。这种目的基因即为油质融合蛋白，此蛋白在营养成分及品质上有了极大提高[6]。过去，人们对Oleosin基因在拟南芥[7]、玉米[8]、大豆[9]、向日葵[10]、油菜[11]等植物中的生物学功能作了大量研究，但是对于花生中Oleosin基因的研究却相对较少[12]。

本文从花生中克隆获得了3个新的油质蛋白基因，分别命名为AhOleosin22a，AhOleosin22b，AhOleosin22c。其基因登录号分别为KP109927，KP109928，KP109929。本文对该基因的表达特性进行了初步研究，为今后的功能研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

采用品种花育33号。参照郝翠翠等[13]的方法进行品种取样前处理。

1.2 总RNA提取与cDNA合成、目的基因的扩增

根据NCBI上搜索到的拟南芥的油质蛋白序列，从花生cDNA文库中找到了3个油质蛋白基因全长序列：AhOleosin22a，AhOleosin22b，AhOleosin22c。引物序列为：AhOleosin22-F：5'-ATGGCTACTGCTACTGATCG-3'；AhOleosin22-R：5'-CTAGAGCTTTAAATTAATATTTTC-3'。参照陈娜等[14-15]的方法进行反转录。用cDNA作模板，通过PCR扩增得到目的基因。

1.3 氨基酸序列分析

ProtParam：蛋白的物理化学参数；TMHMM 2.0 Server：蛋白的跨膜结构；SCRATCH Protein Predicter Tool：蛋白的二级结构。

1.4 多序列比对与系统发育分析

为了研究Oleosin的系统发育关系，我们从NCBI，phytozome，peanutbase数据库下载了Oleosin的蛋白序列：拟南芥(Arabidopsisthaliana)，大豆(Glycinemax)，蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)，油菜(Brassicarapa)，马铃薯(Solanumtuberosum)，狭叶羽扇豆(Lupinusangustifolius)，相思豆(Abrusrecatorius)，花生野生种(Arachisipaensis)和(Arachisduranensis)。采用ClustalW软件对搜索获得的序列进行多序列比对分析[16]，采用MEGA 7.0软件进行系统发育分析，系统发育树采用Neighbour-Joining方法构建。

1.5 荧光定量PCR

荧光定量采用Actin11作为内参基因，3次重复，实验数据使用2-△△Cp方法分析[17]。采用如下引物：

qAhOleosin22-F: 5'-ACGGTACCATGGCTGAC

ATTCAACA-3'；

qAhOleosin22-R:5'-ATTCTGCAGTCAGGACG

ATGTTTTCTT-3'；

qACT11-F:5'-TTGGAATGGGTCAGAAGGATGC-3'；

qACT11-R:5'-AGTGGTGCCTCAGTAAGAAGC-3'。

2 结果与分析

2.1 AhOleosin22a，AhOleosin22b和AhOleosin22c基因克隆

AhOleosin22a基因全长为630bp，编码210个氨基酸；AhOleosin22b基因全长为636bp，编码212个氨基酸；AhOleosin22c基因全长582bp，编码194个氨基酸(图1，图2和图3)。

2.2 氨基酸序列分析

对AhOleosin22a，AhOleosin22b和AhOleosin22c基因编码的蛋白质进行理化性质分析。AhOleosin22a蛋白的理论分子量为22.04 kD，理论等电点为6.06。AhOleosin22a包含的210个氨基酸残基中，Ser(S)含量最高，占总氨基酸的13.8%，其次为Ala(A)和Thr(T)，分别占总氨基酸的11.9%和10.5%。带负电的氨基酸有19个(Asp+Glu)，带正电的氨基酸有17个(Arg+Lys)。亲水指数为0.157，不稳定系数48.49，属于不稳定蛋白。TMHMM在线工具预测发现，AhOleosin22a有3个跨膜结构，推测AhOleosin22a属于跨膜类蛋白。SCRATCH Protein Predicter Tool结果显示：AhOleosin22a含α-螺旋94个，占44.76%；α-延伸26个，占12.38%；无规则卷曲90个，占 42.86%。AhOleosin22b蛋白的理论分子量为22.09 kD，理论等电点为5.76。AhOleosin22b包含的212个氨基酸残基中，Ser(S)含量最高，占总氨基酸的14.2%，其次为Ala(A)，Thr(T)分别占总氨基酸的12.3%，10.4%。带负电的氨基酸有19个(Asp+Glu)，带正电的氨基酸有16个(Arg+Lys)。亲水指数为0.131，不稳定系数是50.25，属于不稳定蛋白。TMHMM在线工具预测发现，AhOleosin22b有3个跨膜结构，推测AhOleosin22b属于跨膜类蛋白。SCRATCH Protein Predicter Tool结果显示：AhOleosin22b含α-螺旋98个，占46.23%；延伸链24个，占11.32%；无规则卷曲90个，占 42.45%。AhOleosin22c蛋白的理论分子量20.74kD，理论等电点为5.58。AhOleosin22c包含的194个氨基酸残基中，Ser(S)含量最高，占总氨基酸的13.4%，其次为Ala(A)，Leu(L)分别占总氨基酸的12.9%，10.3%。带负电的氨基酸17个(Asp+Glu)，带正电的氨基酸12个(Arg+Lys)。亲水指数0.021，不稳定系数是53.51，属于不稳定蛋白。TMHMM在线工具预测发现，AhOleosin22c有3个跨膜结构，推测AhOleosin22c属跨膜类蛋白。SCRATCH Protein Predicter Tool结果显示：AhOleosin22c含α-螺旋95个，占48.97%；延伸链19个，占9.79%；无规则卷曲80个，占41.24%。

图1 AhOleosin22a基因的核苷酸及氨基酸序列

图2 AhOleosin22b基因的核苷酸及氨基酸序列

图3 AhOleosin22c基因的核苷酸及氨基酸序列

多序列比对分析显示，AhOleosin22a和AhOleosin22b与花生野生种(Arachisipaensis)序列相似性最高，均达到了100%，AhOleosin22a与相思豆(Abrusrecatorius)相似性最低(52.98%)，而AhOleosin22b与马铃薯(Solanum tuberosum)相似性最低(47.95%)。AhOleosin22c与花生栽培种(Arachisduranensis)序列相似性最高(99.45%)，与马铃薯(Solanumtuberosum)相似性最低(47.59%)。编码蛋白与其他植物蛋白Oleosin22序列同源，因此可能有着共同的祖先[18](图4)。

2.3 系统发育树分析

图5所示，AhOleosin22a，AhOleosin22b和AhOleosin22c与野生种花生油质蛋白基因聚在一起，大豆、狭叶羽扇豆、相思豆、拟南芥(NP_186806)油质蛋白聚在一起，形成一个分支。而拟南芥(NP_198858)油质蛋白基因与油菜、马铃薯、紫花苜蓿基因聚在一起，形成另外一个分支。

图4 AhOleosin22蛋白与其他物种的油质蛋白的氨基酸序列比对

图5 植物Oleosin22基因系统发育树

2.4 基因的表达特性分析

荧光定量PCR分析显示(图6)，AhOleosin22基因在种子中的表达量最高。在种子发育过程中，AhOleosin22基因表达量呈现下降的趋势。

如图7所示，在多种逆境和激素处理下，AhOleosin22基因的表达呈现不同的模式，表明它可能参与了花生逆境胁迫抗性的调节过程[18]。低温和过氧化氢处理24 h时，基因表达量最高。高盐和干旱处理后12 h时基因表达出现峰值。水杨酸和脱落酸处理12h时，基因的表达量远高于其他时期，均为0 h对照的7倍。茉莉酸和乙烯利处理24 h时，基因表达量最高，分别为0 h对照的20倍和10倍。赤霉素处理8h，基因表达量达到最高，约为0 h对照的4倍。

图6 AhOleosin22基因在花生不同组织和种子不同发育时期的表达分析

图7 AhOleosin22基因在非生物逆境胁迫和激素处理下的表达分析

3 结论及讨论

油质蛋白是存在于某些植物脂质贮存组织中的蛋白质，和磷脂一起包围在油质体外面起到稳定作用[19]。花生油质蛋白在花生中高水平积累且拥有表达外源蛋白较好的效果。

本文首先对AhOleosin22的基因与蛋白序列进行分析总结了很多理化参数，发现了该基因所编码的蛋白以α-螺旋构型为主，且有跨膜结构，极有可能为跨膜蛋白。利用TMHMM 2.0 Server预测，其中AhOleosin22的3个跨膜区分别为26～48位、52～74位、81～103位。跨膜蛋白的疏水区往往也是其跨膜区，因此这三个区域拥有较强的疏水作用，疏水作用是油体稳定的基础[20]，也是解决油质酸败问题的研究方向。

其次，多序列分析与进化树的构建将该蛋白与其他物种的亲缘性更好地定位，最后采用荧光定量将该基因在不同条件下进行表达，也十分直观地表达了不同时间不同处理的结果差异是十分显著的。本文的荧光定量实验中发现该基因在种子中表达显著，推测出油质蛋白的启动子可能具有较强的特异性，这与曹仪植、杨素铀的结论相一致[21]。

这些发现与探索为油质蛋白在基因工程的进一步研究提供了良好的理论基础，为油质蛋白在花生品质的改良方向开辟了一片新天地。