肺炎支原体RNA和DNA检测在儿童支原体感染诊断中的应用评价

常娅莉 高岭

肺炎支原体(MP)是介于病毒和细菌之间的原核细胞型微生物[1]。MP主要通过呼吸道的飞沫进行传播，是引发小儿肺炎、支气管炎等下呼吸道感染的常见病原菌[2]。MP感染在青少年更容易发生，数据[3]统计显示30%的呼吸道感染患儿伴有MP感染。MP感染者除了呼吸道感染外，还可能累及其他器官系统，引发脑膜炎、心包炎等其他感染疾病，严重影响儿童的身体健康。因此有效检出MP感染，对于患儿的治疗和预后均有重要意义[4]。MP感染检测的常用方法包括血清学检测、快速培养法以及核酸检测法等，但是快速培养法中样本中的其他病原体会对结果造成干扰，且耗时，操作繁琐，而血清学检测时，检测结果与患者自身的免疫功能和抗体的转化有一定的相关性，假阴性的概率较高[5]。肺炎支原体DNA实时荧光定量PCR(MP-DNA) 法是临床应用较多的一种核酸检测方法，仅需少量DNA片段即能进行扩增检测，灵敏度佳，但是仍存在一定比例的假阴性、假阳性[6]。肺炎支原体RNA实时荧光核酸恒温扩增检测技术(MP-SAT)是一种新型的核酸检测法，它以活菌中的特异性RNA片段进行扩增检测，具有操作简便，灵敏度高的特点，但是在临床上相关应用研究不多[7]。本次研究对MP的RNA和DNA的检测在儿童支原体感染诊断中的应用效果进行了评价比较。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年10月至2018年12月我院收治的86例肺炎患儿作为研究对象。其中男47例，女39例。年龄0.3～15岁，平均年龄(6.9±2.3)岁。本次研究已经医院的医学伦理委员会批准通过。病例纳入标准：经临床诊断符合获得性肺炎的相关标准；年龄≤15岁；之前4周内未接受到抗生素治疗；患者的家属均知情同意并签署同意书。病例排除标准：存在心肝肾等重要脏器功能障碍者；合并有肺结核、哮喘等其他肺部器官疾病者；无法配合完成治疗和随访者。

1.2 方法 对所有患儿在入院24 h内进行采集咽拭子标本，并分别用MP-SAT进行检测RNA和MP-DNA法进行检测DNA。采用美国ABI公司的7500型实时荧光定量PCR仪进行检测RNA和DNA。其中MP-SAT试剂盒和MP-DNA试剂盒分别由上海仁度生物技术有限公司和中山大学达安基因股份有限公司提供。严格按照检测试剂盒的相关操作说明进行操作，其MP-SAT的判读标准为：dt值≤35为阳性，dt值≥40为阴性，介于两者之前的对样本重新扩增后，以dt值≤35为阳性，dt＞35为阴性。MP-DNA的判读标准为：ct值＜30为阳性；ct值≥30为阴性。

根据患儿的临床症状、体征以及其他辅助检查等方式进行综合诊断，明确患儿MP感染的情况。所有患儿均采用大环内酯抗生素进行治疗，对于确诊为MP感染的患儿在治疗期间的1周、2周以及3周进行重复检测MP的RNA和DNA。

1.3 观察指标 以最终综合诊断的患儿MP感染结果作为诊断金标准，比较MP的RNA和DNA的检测在儿童支原体感染诊断中的应用效果，计算其诊断的灵敏度、特异度以及准确率。灵敏度＝真阳性人数/(真阳性人数＋假阴性人数)×100%。特异度＝真阴性人数/(真阴性人数＋假阳性人数)×100%。准确性＝(真阳性人数＋真阴性人数)/(真阳性人数＋假阴性人数＋真阴性人数＋假阳性人数)×100%。并统计比较MP感染阳性患儿在治疗期间不同时间点的RNA和DNA的检测的阳性率变化情况。

1.4 统计学处理 采用SPSS 22.0统计学软件进行处理，计量数据采用(±s)表示，组间比较采用t检验，计数数据采用率进行表示，组间比较采用卡方检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 RNA和DNA检测在儿童MP感染诊断中的应用效果比较 经最终诊断，86例患儿中MP感染阳性49例，MP感染阴性37例。其中MP-SAT检测诊断的MP感染阳性者43例，阴性34例；MP-DNA检测的MP感染阳性者31例，阴性27例(表1)。

表1 RNA和DNA检测在儿童MP 感染诊断中的应用效果比较(n)

2.2 RNA和DNA检测在儿童MP感染诊断的诊断效能分析 MP-SAT检测诊断儿童MP感染的灵敏度、特异度、准确性分别为87.76%、91.89%、89.53%，MP-DNA检测诊断儿童MP感染的灵敏度、特异度、准确性分别为63.27%、72.97%、67.74%，MP-SAT检测诊断的灵敏度、特异度、准确性均高于MP-DNA检测诊断，差异有统计学意义(P＜0.05，表2)。

表2 RNA和DNA检测在儿童MP 感染诊断的诊断效能分析 单位：%

3 讨论

在小儿肺炎的致病菌中，肺炎支原体的所占比例仅次于肺炎链球菌，因此肺炎支原体肺炎(MPP)是常见的小儿肺炎类型之一[8]。MPP患儿没有典型性的临床症状，多数表现为咳嗽、发热、头疼等，严重的情况下还会引发多系统的肺外感染症状。由于MP缺乏细胞壁，因此针对细胞壁合成进行抑制发挥抗菌机制的万古霉素以及β- 内酰胺类抗生素治疗的效果并不理想，需要采用阿奇霉素等大环内酯类抗生素治疗，以控制细胞内的蛋白质合成[9]。因此不同的肺炎类型的治疗方案不同，需要及时明确诊断MP感染，以便为临床治疗提供参考依据。支原体培养法是MP感染检测的金标准，但是培养周期长，操作繁杂，不能满足临床快速检测的要求[10]。MP-抗体的血清学检测存在一定的窗口期，在感染早期约1周内的敏感性较低，且容易受到机体免疫水平影响[11]。核酸检测也是MP感染检测的一种方法，其中以MP-DNA法检测最为常用。MP-DNA法对基因的DNA片段进行扩增和检测，与常规的血清学检测相比，灵敏度高[12]。但是DNA片段在进行PCR扩增时，若操作不规范可能造成感染，出现假阳性、假阴性，影响诊断的准确性。SAT是一种新型的核酸检测技术，SAT以活体中的RNA作为靶目标，采用M-MLV反转录酶以及T7RNA多聚酶等进行恒温的扩增，从而对病原菌RNA进行检测[13]。SAT技术在结核分枝杆菌、肠道病毒71型等的检测中均得到了较好的应用效果，其中诊断效能优于血清MP抗体检测。且RNA只能在病原菌活体中存在，MP细胞死亡后，细胞内的RNA会快速降解，而DNA的降解周期较长，因此应用SAT方法进行MP检测，还能较好的提示MP感染的治疗好转情况[14]。本次研究对MP的RNA和DNA的检测在儿童支原体感染诊断中的应用效果进行了评价比较，结果中MP-SAT检测诊断儿童MP感染的灵敏度、特异度、准确性分别为87.76%、91.89%、89.53%，高于常规的MP-DNA法检测。结果 与林苗苗等[15]的研究一致，显示在儿童支原体感染的诊断中，RNA实时检测相对而言检测的灵敏度和准确性更高，应用价值良好。

综上所述，在儿童支原体感染的诊断中，RNA实时检测相对而言检测的灵敏度和准确性更高，应用价值良好。