粘质沙雷氏菌膜结合葡萄糖酸脱氢酶的分离纯化及其酶学特性

王贝贝，李昊聪，孙文敬,2,*，崔凤杰,2，王大明，钱静亚,2，齐方辉

（1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013；2.江莫省德兴市百勤异VC钠有限公司，江莫 德兴 334221；3.江南大学生物工程学院，江苏 无锡 214122）

粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）为杆状兼性厌氧的革兰氏阴性菌，广泛存在于土壤、水体、植物、动物与人体肠道等环境中，是一种临床上常见的机会致病菌[1-2]。同时，粘质沙雷氏菌又是一种具有广阔应用前景的微生物资源，能够利用多种可再生碳源发酵生产许多高附加值的工业产品[3-6]。其中，利用粘质沙雷氏菌转化葡萄糖为2-酮基葡萄糖酸（2-ketogluconic acid，2KGA）的研究已有较多文献报道[7-9]。2KGA是杂环化合物合成、区域选择性和立体选择性化学反应中的基础材料[10]，目前大量用于食品抗氧化剂D-异抗坏血酸及其盐类的工业生产中[11-15]。

粘质沙雷氏菌属于氧化细菌，其细胞质膜上存在着与呼吸链相连的葡萄糖直接氧化系统[16-17]。该系统由膜结合的吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶（glucose dehydrogenase，GDH）[18-19]和膜结合的黄素腺嘌呤二核苷酸依赖性葡萄糖酸脱氢酶（gluconate dehydrogenase，GADH）[20-22]组成。在细胞的周质空间中，GDH催化氧化来源于培养环境的葡萄糖为葡萄糖酸，而后GADH催化氧化葡萄糖酸为2KGA[23-24]。

作为氧化细菌葡萄糖代谢过程中一种重要的酶，多年来有关膜结合GADH的纯化与酶学特性研究受到相关学者的关注。到目前为止，分离纯化的膜结合GADH均来源于氧化细菌，如假单胞菌（Pseudomonas）[20-22]、克雷伯氏菌（K l e b s i e l l a）[22]、醋酸杆菌（Acetobacter）[22]、葡萄糖酸杆菌（Gluconobacter）[25-26]、欧文氏菌（Erwinia）[27]、沙雷氏菌[28]等。相关研究结果表明，微生物来源的膜结合GADH均具有3 个亚基。其中：大亚基（脱氢酶亚基）为黄素蛋白，分子质量为64.0～68.0 kDa；中亚基（细胞色素C亚基）含有细胞色素C，可能参与呼吸链中的电子传递，分子质量为45.0～52.5 kDa；小亚基的功能尚不明确，分子质量为15.5～22.0 kDa。尽管微生物来源的膜结合GADH结构组成相似，但酶学性质（如最适反应温度、最适反应pH值）存在较大的差异。

粘质沙雷氏菌JUIM03是本实验室从土壤中筛选的2KGA高产菌株，有望应用于工业生产中。本研究以粘质沙雷氏菌JUIM03为材料，利用Triton X-114相分离法[29-30]提取膜蛋白，然后分离纯化其中的GADH。在此基础上，考察纯化的膜结合GADH的酶学性质，了解环境因子对其催化活性的影响，以期为粘质沙雷氏菌2KGA生物合成的过程优化与控制提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens）JUIM03，由本实验室筛选保藏。

1.1.2 培养基

斜面培养基：蛋白胨10.0 g/L，牛肉膏5.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，琼脂粉20.0 g/L，pH 7.0。

菌种扩大培养基：葡萄糖22.0 g/L，玉米浆粉5.0 g/L，尿素2.0 g/L，KH2PO42.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，轻质CaCO31.0 g/L，pH 7.0。

1.1.3 试剂

Triton X-114、Triton X-100、2,6-二氯靛酚（2,6-dichloroindophenol，DCIP）、吩嗪硫酸甲酯（phenazine methosulfate，PMS）、改良型Bradford法蛋白质浓度测定试剂盒、DEAE-Sepharose Fast Flow填料生工生物（上海）股份有限公司；5×Protein十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）Loading Buffer、Premixed Protein Marker（Low） 宝生物工程（大连）有限公司；2KGA钙盐标准品 江莫省德兴市百勤异VC钠有限公司；考马斯亮蓝G250 国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

TGL-18M型台式高速冷冻离心机 上海卢湘仪离心机仪器有限公司；L5型紫外-可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；BILON98-IIIDL型超声波细胞破碎仪、YC-1型层析冷柜 上海比郎仪器有限公司；1260 Infinity高效液相色谱仪 美国Agilent公司；LPC-201型自动中低压层析系统 北京众益中和生物技术有限公司；Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO30kDA）美国Milipore公司；Hydroxyapatite Fast Flow预装柱（5 mL）、PowerPac Basic型电泳仪、GelDocTMXR+型凝胶成像仪 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的分离纯化

1.3.1.1 菌体细胞的培养与超声破碎

从斜面中挑取活化的粘质沙雷氏菌JUIM03，接种于菌种扩大培养基（500 mL三角瓶的培养基装量为50 mL）中，30 ℃、265 r/min的条件下振荡培养20 h，然后8 000 r/min离心10 min回集菌体，并用无菌水洗涤2 次。将回集的菌体细胞悬浮于含有10 g/L TritonX-114和150 mmol/L NaCl的10 mmol/L的Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）中，调整细胞浓度至OD650nm为45.0左右，随后在4 ℃、900 W的条件下超声破碎细胞60 min，并对细胞的破碎效果进行镜检观察。

1.3.1.2 Triton X-114相分离法提取膜蛋白

在4 ℃、12 000 r/min条件下离心细胞破碎液30 min，弃去沉淀。将上清液置于37 ℃的水浴中保温15 min，然后在25 ℃、12 000 r/min条件下离心5 min，使两相分离（上层为水相，下层为去污剂相，膜蛋白溶解于去污剂相中）并分别回集。方回集的水相中添加TritonX-114至10 g/L，4 ℃下搅拌15 min至混合均匀，然后重复上述的两相分离步骤。将3 次两相分离得到的去污剂相合并，加入4 ℃的磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）定容至离心所得上清液的原体积，4 ℃搅拌15 min，然后置于37 ℃水浴中保温15 min，25 ℃、12 000 r/min离心5 min，使两相分离。取去污剂相继续加入4 ℃的PBS，再次进行两相分离，最后得到的去污剂相作为粘质沙雷氏菌膜结合GADH的粗酶液。

1.3.1.3 膜结合GADH的分离纯化

参照文献[22]的方法对粗酶液进行盐析，回集硫酸铵饱和度为25%～45%之间的沉淀组分。将盐析得到的沉淀物悬浮于含有1 g/L TritonX-100、5 mmol/L MgCl2·6H2O和10 mmol/L D-葡萄糖酸钠的10 mmol/L的磷酸钾缓冲液（pH 6.0，以下简称为缓冲液A）中并透析过夜。4 ℃、12 000 r/min条件下离心透析液5 min，然后将上清液上样至已用缓冲液A平衡过的DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换柱（1.2 cm×60 cm）中，并依次用缓冲液A、含有0.1 mol/L KCl的缓冲液A、含有0.3 mol/L KCl的缓冲液A和含有0.5 mol/L KCl的缓冲液A洗脱，分部回集洗脱组分并测定其蛋白浓度和GADH活性。合并DEAE-Sepharose层析过程中回集的具有GADH活性的洗脱组分，超滤浓缩后用含有5 mmol/L MgCl2·6H2O和10 mmol/L D-葡萄糖酸钠的10 mmol/L的磷酸钠缓冲液（pH 7.0，以下简称为缓冲液B）透析，再上样至经缓冲液B平衡过的Hydroxyapatite预装柱（5 mL）中。上样结束后，依次用缓冲液B、含有5 mmol/L MgCl2·6H2O和10 mmol/L D-葡萄糖酸钠的100 mmol/L的磷酸钠缓冲液（pH 7.0）、含有1 g/L TritonX-100、5 mmol/L MgCl2·6H2O和10 mmol/L D-葡萄糖酸钠的150 mmol/L的磷酸钠缓冲液（pH 7.0）进行洗脱，然后分部回集洗脱组分。超滤浓缩具有GADH活性的洗脱组分，保存于-20 ℃备用。

1.3.2 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的酶学性质分析

1.3.2.1 反应温度对膜结合GADH催化活性的影响及热稳定性分析

保持酶促反应的其他条件不变，考察反应温度对酶活力的影响，确定膜结合GADH的最适反应温度。将最适反应温度下样品的酶活力定义为100%，以此计算其余温度下样品的相对酶活力。

将纯化的膜结合GADH置于不同的温度下保温处理一定时间，然后迅速冷却并在最适反应温度下测定其残留的酶活力。将未经保温处理的样品在相同条件下的酶活力定义为100%，以此计算不同保温处理条件下样品的相对酶活力。

1.3.2.2 反应pH值对膜结合GADH催化活性的影响及pH值稳定性分析

保持其他反应条件不变，考察反应pH值对酶活力的影响，确定膜结合GADH的最适反应pH值。将最适反应pH值下样品的酶活力定义为100%，以此计算其余pH值条件下样品的相对酶活力。

将纯化的膜结合GADH与不同pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液（McIlvaine缓冲液）混合均匀，4 ℃处理16 h，然后在pH 6.0的反应体系中测定各个处理样品的酶活力，考察膜结合GADH的pH值稳定性。将测得的处理样品的最高酶活力定义为100%，以此计算其余pH值处理下样品的相对酶活力。

1.3.2.3 金属离子对膜结合GADH催化活性的影响

配制含有不同浓度、不同种类金属离子的酶促反应体系，保持其他反应条件不变，在pH 6.0、最适反应温度下考察金属离子对酶活力的影响。将未经金属离子处理的样品在相同条件下的酶活力定义为100%，以此计算不同浓度、不同种类金属离子处理样品的相对酶活力。

1.3.2.4 变性剂和乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）对膜结合GADH催化活性的影响

将纯化的膜结合GADH分别加入含有不同浓度的脲、巯基乙醇、SDS和EDTA的反应体系中，保温处理1 h，然后在最适反应温度下测定各个样品的残留酶活力。将未经变性剂和EDTA处理的样品在相同条件下的酶活力定义为100%，以此计算不同处理下样品的相对酶活力。

1.3.2.5 有机溶剂对膜结合GADH催化活性的影响

配制含有不同浓度、不同种类有机溶剂的酶促反应体系，以不添加任何有机溶剂的反应体系为对照，保持其他反应条件不变，在最适反应温度下考察有机溶剂对酶活力的影响。

1.3.2.6 有机酸对膜结合GADH催化活性的影响

配制含有不同浓度、不同种类有机酸的酶促反应体系，以不添加任何有机酸的反应体系为对照，保持其他反应条件不变，在最适反应温度下考察有机酸对酶活力的影响。

1.3.2.7 膜结合GADH的底物特异性

分别利用相同浓度的不同碳源替代D-葡萄糖酸钠作为酶促反应体系中的底物，在最适反应条件下测定膜结合GADH的催化活性。将D-葡萄糖酸钠作为底物时的酶活力定义为100%，以此计算不同底物条件下膜结合GADH的相对酶活力。

1.3.2.8 膜结合GADH的Km值和Vm值

在pH 6.0、25 ℃的条件下，测定膜结合GADH催化氧化不同浓度D-葡萄糖酸钠的反应初速度。利用Lineweaver-Burk双倒数作图法，计算膜结合GADH的米氏常数Km和最大反应速度Vm。

1.3.3 分析方法

1.3.3.1 膜结合GADH的酶活力测定

参照Matsushita等[22]的方法进行测定。反应体系（3.0 mL）：10 mmol/L DCIP 0.1 mL，3 mmol/L PMS 0.1 mL，1.0 mol/LD-葡萄糖酸钠0.1 mL，100 mmol/L磷酸钾缓冲液（pH 6.0）1.0 mL，适量的膜结合GADH和蒸馏水。酶活力单位（U）的定义：25 ℃条件下，在上述反应体系中，每分钟还原1.0 μmol DCIP或者氧化1.0 μmolD-葡萄糖酸钠所需要的酶量。比活力的定义：每毫克蛋白所具有的酶活力。

1.3.3.2 蛋白质的测定与SDS-PAGE分析

参照文献[18]方法。

1.3.3.3 膜结合GADH大亚基中黄素腺嘌呤二核苷酸的预测

参照Shinagawa等[25]的方法进行预测。

1.3.3.4 膜结合GADH中细胞色素C的定性分析

参照Shinagawa等[28]的方法，将纯化得到的膜结合GADH于0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液（pH 7.0）中透析过夜，调整其蛋白质量浓度为0.1 mg/mL左右。方酶液中加入适量的D-葡萄糖酸钠或铁氰化钾，使膜结合GADH呈还原型或氧化型。以0.1 mol/L的磷酸钾缓冲液（pH 7.0）为对照，分别测定还原型或氧化型膜结合GADH在波长400～600 nm的吸回光谱。

1.3.3.5 膜结合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成的产物分析

反应体系：32 mmol/LD-葡萄糖酸，16 mmol/L轻质CaCO3，0.1 mmol/L PMS和适量纯化膜结合GADH酶液，用蒸馏水定容。反应条件为30 ℃、24 h。在反应液中加入5 g/L的活性炭，75 ℃搅拌脱色20 min；抽滤除去不溶物，减压（-0.096 MPa）浓缩滤液至无色结晶出现；4 ℃结晶4 h，过滤得到反应产物；真空干燥，获得无色粉末状样品，即为提取的反应产物。将适量的2KGA（钙盐）标准品和反应产物分别溶解于0.01 mol/L的KH2PO4溶液（pH 3.0），经0.22 μm滤膜过滤，备用，进行高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。HPLC采用Hypersil SAX色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相0.01 mol/L KH2PO4（pH 3.0）；流速1.0 mL/min；紫外检测器；检测波长216 nm；柱温30 ℃；进样量5 μL。

2 结果与分析

2.1 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的分离纯化

表1 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的纯化Table 1 Summary of puri fication procedures of membrane-bound GADH from S. marcescens

图1 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的DEAE-Sepharose离子交换层析Fig. 1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatography of membranebound GADH from S. marcescens

图2 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的Hydroxyapatite柱层析Fig. 2 Hydroxyapatite chromatography of membrane-bound GADH from S. marcescens

粘质沙雷氏菌膜结合GADH的分离纯化结果如表1所示。Triton X-114相分离法是一种有效的膜蛋白提取方法。通过水相与去污剂相的分离，大部分的亲水性蛋白被去除，膜结合GADH被纯化了2.2 倍，且具有较高的回回率。在利用盐析从提取膜蛋白中分离纯化GADH的过程中，硫酸铵饱和度为25%～45%时，沉淀的蛋白具有很高的GADH活性，而从其他饱和度下的沉淀物中基本检测不到GADH活力。经过盐析处理后，膜结合GADH被进一步纯化到3.3 倍，同时除去了膜蛋白中的Triton X-114。利用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析纯化盐析得到膜蛋白时，用含有0.1 mol/L KCl的缓冲液A洗脱的组分具有较高的GADH活性，其最大比活力为88.95 U/mg（图1）。经过阴离子交换纯化后，膜结合GADH的比活力提高至80.95 U/mg，纯化倍数增加至142.0 倍。利用Hydroxyapatite Fast Flow层析对经过阴离子交换处理的膜蛋白进行纯化的过程中，用含有1 g/L TritonX-100、5 mmol/L MgCl2·6H2O和10 mmol/L D-葡萄糖酸钠的150 mmol/L的磷酸钠缓冲液（pH 7.0）洗脱的组分具有较高的GADH活性，其最大比活力为103.25 U/mg（图2）。经过上述纯化，获得了比活力为91.43 U/mg的粘质沙雷氏菌膜结合GADH，其最终的纯化倍数为160.4，回回率为3.8%。

2.2 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的结构分析

2.2.1 膜结合GADH的SDS-PAGE分析

图3 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of membrane-bound GADH from S. marcescens

从图3可以看出，经盐析处理后，大部分的杂蛋白被除去；经DEAE-Sepharose阴离子交换层析后，具有GADH活性的洗脱液中的杂蛋白进一步减少；经Hydroxyapatite层析后，SDS-PAGE的凝胶上显示出3 条明显的条带，分别对应的分子质量大约为65.0、45.0、23.0 kDa。上述结果表明，来源于粘质沙雷氏菌JUIM03的膜结合GADH由3 个亚基组成，即65.0 kDa的大亚基（脱氢酶亚基）、45.0 kDa的中亚基（细胞色素C亚基）和23.0 kDa的小亚基，与来源于其他氧化细菌[20-22]的膜结合GADH在亚基组成上一致。

2.2.2 膜结合GADH大亚基中黄素腺嘌呤二核苷酸的预测

参照Shinagawa等[25]的方法，对纯化的粘质沙雷氏菌膜结合GADH进行SDS-PAGE分离，然后将未染色的分离胶置于紫外光下，在对应大亚基（脱氢酶亚基）的条带位置可以观察到荧光出现，说明纯化的膜结合GADH大亚基中应该含有黄素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide，FAD）。用10%的三氯乙酸对纯化的膜结合GADH进行处理，然后对其进行SDS-PAGE分离，再将未染色的分离胶置于紫外光下，仍能在对应大亚基条带的位置观察到荧光出现，说明FAD与大亚基之间应该是以共价键紧密结合的，即FAD在膜结合GADH中以辅基而不是辅酶的形式存在。

2.2.3 膜结合GADH中细胞色素C的定性分析

还原型的细胞色素C在可见光区具有特征性的吸回光谱，在波长550～555、520～525 nm和415～420 nm处有3 个吸回峰，即α吸回峰、β吸回峰和γ吸回峰。膜结合GADH中含有细胞色素C，其还原型的吸回光谱中具有典型的细胞色素C吸回峰；同时，因为膜结合GADH中含有FAD，属于黄素蛋白，其还原型在450 nm区域的吸光度明显低于其氧化型的吸光度[28]。

图4 纯化的粘质沙雷氏菌膜结合GADH的吸收光谱Fig. 4 Absorption spectra of purified membrane-bound GADH from S. marcescens

从图4可以看出，该酶还原型的吸回光谱中有3 个吸回峰，分别处于419、520、554 nm的位置，且其在450～500 nm区域内的吸光度明显低于其氧化型的吸光度，可以认为本研究纯化的膜结合GADH是含有细胞色素C的黄素蛋白。

2.2.4 膜结合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成产物分析

2KGA是由膜结合的FAD依赖性GADH催化葡萄糖酸形成的产物[31]。从粘质沙雷氏菌JUIM03纯化的膜结合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成的产物在HPLC中的保留时间为4.382 min，与2KGA钙盐标准品在HPLC中的保留时间4.287 min一致（图5），说明本研究所纯化的膜结合GADH可能是FAD依赖性GADH。

图5 膜结合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成的产物的HPLC分析Fig. 5 HPLC analysis of the products formed from D-gluconic acid under the catalysis of membrane-bound GADH

2.3 粘质沙雷氏菌膜结合GADH的酶学性质

2.3.1 膜结合GADH的最适反应温度和热稳定性

在20～40 ℃的范围内，粘质沙雷氏菌JUIM03膜结合GADH的催化活性随着反应温度的升高而增大，在温度达到40 ℃时活性最大；当反应温度高于40 ℃时，酶活力迅速下降，在60 ℃时几乎无法检测到膜结合GADH活力（图6）。粘质沙雷氏菌JUIM03膜结合GADH的最适反应温度为40 ℃，明显高于来源于2KGA工业发酵常用的假单胞菌的膜结合GADH最适反应温度（30 ℃）[20-22]，从侧面预示了沙雷氏菌和假单胞菌2KGA合成对温度条件的不同要求。

图6 温度对膜结合GADH催化活性的影响Fig. 6 Effect of temperature on membrane-bound GADH activity

30 ℃保温45 min，粘质沙雷氏菌JUIM03膜结合GADH活力没有变化；40 ℃保温45 min，酶活力降低了30%左右；50 ℃保温30 min，酶活力降低了80%以上；60 ℃保温15 min，酶活力完全丧失（图7）。

图7 膜结合GADH的热稳定性Fig. 7 Thermal stability of membrane-bound GADH from S. marcescens

2.3.2 膜结合GADH的最适反应pH值和pH值稳定性

图8 pH值对膜结合GADH催化活性和稳定性的影响Fig. 8 Effect of pH on membrane-bound GADH activity and stability

如图8所示，反应体系的pH值从3.0升至5.0的过程中，膜结合GADH的催化活性呈上升趋势；反应体系的pH值从5.0升至8.0的过程中，酶的催化活性逐步降低直至完全失活。因此，该酶最适反应pH值为5.0。将纯化的膜结合GADH置于pH 5.0～7.0的缓冲液中处理16 h后，其酶活力没有发生明显的变化； 在pH值低于5.0或高于7.0的缓冲液中对膜结合GADH进行处理，都会导致其酶活力的明显下降。

2.3.3 金属离子对膜结合GADH催化活性的影响

图9 金属离子对膜结合GADH催化活性的影响Fig. 9 Effect of metal ions on membrane-bound GADH activity

从图9可以看出，膜结合GADH活力基本不被Na+影响；Mg2+对该酶的催化活性略有促进作用；低浓度的Mn2+对酶活力略有促进作用，而随着浓度的增加又会抑制酶活力。Ni2+、Cd2+、Fe3+、Cu2+和Zn2+对膜结合GADH的催化活性均有抑制作用，且浓度越高抑制作用越强。其中，100 mmol/L的Fe3+、Cu2+或Zn2+均可使膜结合GADH活力丧失85%以上，甚至可完全抑制其活力。

2.3.4 变性剂和EDTA对膜结合GADH催化活性的影响

脲和EDTA对膜结合GADH的催化活性基本没有影响，而巯基乙醇和SDS对膜结合GADH的催化活性均有抑制作用。10 mmol/L的巯基乙醇可使该酶活力下降30%左右；10 mmol/L的SDS可使该酶活力丧失90%左右（表2）。

表2 变性剂和EDTA对膜结合GADH催化活性的影响Table 2 Effects of denaturants and EDTA on membrane-bound GADH activity

2.3.5 有机溶剂对膜结合GADH催化活性的影响

有机溶剂通过降低酶分子周围介质的极性、增加酶分子周围环境的疏水性而影响酶活力。如图10所示，甘油对膜结合GADH的催化活性没有影响，而甲醇、丙酮、异丙醇和乙醇对其具有明显的抑制作用。在反应体系中有机溶剂体积分数为15%的条件下，甲醇或丙酮可使膜结合GADH的催化活性丧失80%左右，异丙醇可使其催化活性丧失90%左右，乙醇几乎能够完全抑制该酶的催化活性。

图10 有机溶剂对膜结合GADH催化活性的影响Fig. 10 Effect of organic solvents on membrane-bound GADH activity

2.3.6 有机酸对膜结合GADH催化活性的影响

乙醇酸、乙醛酸和2KGA对膜结合GADH的催化活性几乎没有影响，而低浓度的草氨酸或草酸能对膜结合GADH的催化活性产生强烈的抑制作用（表3）。15 mmol/L的草酸可使膜结合GADH活力降低30%左右，5 mmol/L的草氨酸可使膜结合GADH活力降低90%以上。

表3 有机酸对膜结合GADH催化活性的影响Table 3 Effect of organic acids on membrane-bound GADH activity

2.3.7 膜结合GADH的底物特异性

以2KGA、DL-苹果酸、L-抗坏血酸、酒石酸、柠檬酸、D-山梨醇、D-果糖、D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖、D-麦芽糖、D-甘露醇或L-阿拉伯糖代替D-葡萄糖酸钠作为酶活力测定体系中的底物时，检测不到膜结合GADH的催化活性。只有以D-葡萄糖酸钠作为底物时，膜结合GADH才具有催化活性。因此，粘质沙雷氏菌膜结合GADH具有严格的底物特异性。

2.3.8 膜结合GADH的Km值和Vm值

图11 双倒数法测定膜结合GADH的米氏常数Fig. 11 Km determination of membrane-bound GADH by Lineweaver-Burk plot

从图11可以看出，在25 ℃、pH 6.0的条件下，反应速率与底物D-葡萄糖酸浓度之间存在线性关系，其拟合方程为y=0.508 6x+0.381 8（R2=0.992 8），由此计算得到的Km值为1.33 mmol/L，最大反应速率Vm为2.62 μmol/（mL·min）。

2.3.9 不同微生物来源的膜结合GADH比较

微生物来源的膜结合GADH均具有严格的底物特异性，即只有在D-葡萄糖酸作为底物时才具有催化活性。在结构和酶学特性上，不同微生物来源的膜结合GADH存在一定差异，主要反映在亚基的分子质量、酶的最适反应温度、酶的最适反应pH值和反应动力学参数Km等方面（表4）。

表4 不同微生物来源的膜结合GADH的性质Table 4 Properties of membrane-bound GADHs from various microorganisms

3 结 论

本研究以2KGA高产菌株粘质沙雷氏菌JUIM03为材料，利用Triton X-114相分离法提取其膜蛋白，经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Hydroxyapatite层析步骤，获得了比活力为91.43 U/mg的粘质沙雷氏菌膜结合GADH，其最终的纯化倍数为160.4 倍，回回率为3.8%。

SDS-PAGE分析表明，从粘质沙雷氏菌JUIM03中纯化的膜结合GADH由3 个亚基组成，其分子质量分别为65.0、45.0、23.0 kDa左右，与来源于其他氧化细菌的膜结合GADH在亚基组成上是一致的。另外，纯化的膜结合GADH的大亚基含有FAD，且FAD以辅基的形式与大亚基共价结合。可见光区吸回光谱分析结果表明，还原型的纯化产物具有还原型细胞色素C的特征性吸回光谱，因此可以认为所纯化的膜结合GADH是含有细胞色素C的黄素蛋白。HPLC分析表明，纯化的膜结合GADH催化氧化D-葡萄糖酸所形成的产物为2KGA，进一步说明了所纯化的膜结合GADH是FAD依赖性GADH。

酶学性质研究结果表明，粘质沙雷氏菌JUIM03膜结合GADH的最适反应温度为40 ℃，最适反应pH值为5.0，在30 ℃以下、pH 5.0～6.0的条件下较为稳定；该酶具有严格的底物特异性，只有在D-葡萄糖酸作为底物时才具有催化活性，其Km值为1.33 mmol/L，Vm为2.62 μmol/（mL·min）；一些金属离子（如Fe3+、Cu2+和Zn2+）、有机溶剂（乙醇、异丙醇、甲醇和丙酮）、变性剂（SDS和巯基乙醇）以及有机酸（草氨酸和草酸）对膜结合GADH的催化活性具有明显的抑制作用。

该研究结果为粘质沙雷氏菌2KGA生物合成的过程优化与控制提供了一定的理论依据，同时也对2KGA酶法生产工艺的开发具有潜在的借鉴作用。