皮诺敛酸纯化方法及其生理功能研究进展

董欣睿,包怡红

(东北林业大学林学院,黑龙江哈尔滨 150040)

皮诺敛酸(Pinolenic acid,PLA)是裸子植物松科种子特有的Δ5型多不饱和脂肪酸的一种,结构式为顺5,9,12-十八碳三烯酸,是必需脂肪酸γ-亚麻酸(GLA)的异构体,虽然PLA不属于必需脂肪酸,但它与必需脂肪酸的作用相似,参与类花生酸的生物合成[1]。不同松子油中所含皮诺敛酸含量不同,如西伯利亚松子(Pinussibirica)PLA含量约为总脂肪酸的19%,红松松子(P.koraiensis)PLA含量约为总脂肪酸的14%[2]。目前PLA的纯化方法主要有尿素包合法[3]、溶剂分馏法[4]、酶法[5]等。皮诺敛酸具有多种生理功能,如减肥[6]、降脂[7-9]、增强胰岛素敏感性[10]、抗炎特性[11]、抑制肿瘤转移[12]等。由于其多种生理功能,研究者尝试采用不同方法对其进行纯化,以提高其产量。对皮诺敛酸的纯化常采用物理方法或酶促反应法[1],但目前国内缺少对皮诺敛酸纯化方法的综述,因此本文主要总结了皮诺敛酸的多种纯化方法,并对其生理功能进行总结,以期为后续关于皮诺敛酸的研究提供参考。

1 皮诺敛酸的纯化方法及检测

提取皮诺敛酸的方法有:物理方法[3,13]、酶促反应法[14-15]、物理法与酶促反应法相结合[5]。目前所报道的物理方法主要包括尿素包合法和溶剂分流法。酶促反应法常采用具有不同专一性的脂肪酶,利用酶的特异性、选择性和高效性,达到纯化皮诺敛酸的目的。为得到更高纯度的皮诺敛酸,有学者尝试将物理法与酶促反应法相结合。

1.1 物理方法

1.1.1 尿素包合法 尿素包合法是一种分离脂肪酸的经典方法。在某些条件下,尿素分子与长链饱和脂肪酸可形成螺旋形结构络合物。尿素分子和长链烷烃之间存在强大的范德华吸引力,长链烷烃被保留在尿素络合物的圆形通道中。大多数尿素包合物是六面体结晶,而纯尿素分子为四面体结晶。具有长链和饱和烃链的烷酸才能形成尿素包合物,而支链和环状分子或链长小于6～8个碳原子的物质很少形成尿素包合物。同样,较短链长的脂肪酸或包含诸如双键以及环氧基或羟基官能团的脂肪酸不可能形成包合物。根据溶剂的选择和尿素与脂肪酸的比例,可以控制尿素包合物中脂肪酸的含量。甲醇或乙醇常被用作溶剂,尿素与脂肪酸的比例越高,就会有更多的脂肪酸与尿素形成复合物[1]。尿素包合法是制备皮诺敛酸最常用的物理方法。Lee等[3]研究显示了不同溶剂中不同尿素与脂肪酸之比对皮诺敛酸纯化结果的影响。结果表明,在乙醇中尿素与脂肪酸的比例分别为1∶1、2∶1和3∶1时,PLA的含量从14.1%增加到16.8%、23.0%和45.1%。在甲醇中,尿素与脂肪酸的比例分别为1∶1、2∶1和3∶1时,PLA的含量从14.1%增至15.1%、20.4%和33.6%。通过在乙醇中尿素与脂肪酸以3∶1的比例进行结晶,可以得到最高的PLA浓度(3.2倍的升高)。杨明非等[16]采用尿素包合法富集混合脂肪酸中皮诺敛酸,皮诺敛酸甲酯质量分数最高达到45.8%。刘志鑫等[17]根据Box-Behnken中心组合试验设计原理,建立皮诺敛酸的尿素包合回归模型,经过多次包合试验,将皮诺敛酸含量由一次包合的39.27%提高到了53.36%。张晶等[18]采用尿素包合法纯化皮诺敛酸,通过优化脂肪酸与尿素的比例、尿素与乙醇的比例、包合温度及包合时间等因素,得到经二次尿素包合纯化后纯度为72.5%的皮诺敛酸。尿素包合法的优势在于其应用设备简单、工艺简便、成本低廉,但难以将双键数接近的脂肪酸分开[19-20]。

1.1.2 溶剂分馏法 分馏(也称为分步结晶)是一种物理过程,它根据可控脂质在受控温度下具有不同不饱和度的脂质成分的溶解度,将可食用脂质(例如TAG或FA)分离为固体馏分和液体馏分[21]。工业规模分馏过程的两种主要类型是干法分馏和溶剂分馏,与干法分馏相比,溶剂分馏的主要优点是分离效率高,目标馏分具有高回收率。由于溶剂分馏法需要大量的设备投资及较高的运营成本,因此其通常用于生产高附加值的脂质产品[22]。使用有机溶剂(例如正己烷或丙酮)进行溶剂分馏可以使更多的具有高熔点的饱和脂质成分结晶,而更多的具有低熔点的不饱和成分仍溶解在溶剂中。溶剂分馏已成功应用于多种有益健康的脂肪酸分离,例如长链n-3多不饱和脂肪酸(例如二十碳五烯酸(C20∶5n-3)和二十二碳六烯酸(C22∶6n-3)[23]和γ-亚麻酸(C18∶3n-6))[24]。

由于PLA的浓缩物适用于功能性食品和营养保健品,具有很大的应用价值,因此采用溶剂分馏法将松子油中获得的游离脂肪酸(FFA)用于制备PLA浓缩物。Chung等[4]将含有18.3%PLA的西伯利亚松子油用作分馏的原料。在低至-85 ℃的超低温下在正己烷中进行分馏,在研究确定的最佳条件下生产的PLA浓缩物(温度为-85 ℃;正己烷与FFA的比例(V/w)为30∶1;分馏时间为36 h)含有69.8%的PLA。在FFA中,PLA的产率为初始PLA重量的77.4%。这些结果表明,与Woo等[13]采用尿素结晶的方法(例如,PLA含量约为47%,PLA的产率可达到77%)或Lee等[14]使用的脂肪酶催化的反应(例如PLA含量约为30%,PLA产率可达到61%)相比,溶剂分馏是一种制备具有更高PLA含量的皮诺敛酸浓缩物的有效方法。此方法还可用于分离其他物质,如Bootello等[25]用溶剂分馏法制备高熔点硬脂精,Kang等[22]通过双溶剂分馏从棕榈硬脂精中选择性富集对称单不饱和三酰基甘油。

1.2 酶促反应法

酶促反应法以其专一性、催化高效性、条件温和性等特点,使其在皮诺敛酸纯化方面的应用引起了人们广泛关注。不同的脂肪酶可以催化不同脂肪酸与醇发生酯化反应。在应用酶促反应法进行皮诺敛酸的纯化时,成功与否取决于脂肪酶的特异性与脂肪酸的特性。在松子油中,油酸和亚油酸是脂肪酸的主要成分,如在红松松子油中,油酸和亚油酸占总油脂的百分比超过70%[26]。因此,从松子油的脂肪酸混合物中消除这两种脂肪酸可有助于PLA的富集。一方面,油酸和亚油酸都是Δ9型不饱和脂肪酸,来自褶皱假丝酵母(Candidarugosa)的脂肪酶具有针对常规Δ9型不饱和脂肪酸的特异性,是对松子仁油和乙醇进行脂肪酸酯化反应的理想酶。通过酯化反应,在褶皱假丝酵母(Candidarugosa)脂肪酶存在的情况下,油酸和亚油酸主要与乙醇反应并形成脂肪酸乙酯。另一方面,PLA是Δ5型不饱和脂肪酸,反应较不容易进行,且仍以未反应的游离脂肪酸形式存在。因此,它可以存在于未反应的脂肪酸部分[1]。最近No等[5]研究了使用褶皱假丝酵母(Candidarugosa)脂肪酶将松子油中的脂肪酸与月桂醇进行酶促酯化反应。通过该反应,PLA占游离脂肪酸组分从最初的13%富集成高达43%。Zhao等[15]使用循环填充床反应器(RPBR)并结合Novozym 435脂肪酶催化,实现从松子油中浓缩生产皮诺敛酸。当最佳温度、摩尔比(松子油:乙醇)和在RPBR中通过脂肪酶催化水解生产PLA浓缩物的最佳停留时间分别为45 ℃、1∶50和3 min时,在反应的最初10 min内,获得了浓缩物中最大的PLA含量(36.1%)。No等[5]采用尿素包合与脂肪酶催化酯化相结合的办法,实现了皮诺敛酸的高效富集。在尿素与脂肪酸之比大于3∶1 (wt/wt)的情况下,可以获得纯度大于95%的PLA,并且在尿素与脂肪酸的比例为5∶1的情况下,可以生产出100%的纯PLA,且收率为8.7%。

1.3 其他纯化方法

除了上述提到的方法外,多不饱和脂肪酸的富集纯化方法还有超临界流体萃取法、脂肪酸金属盐法、银离子络合法等[27]。超临界流体萃取法常用CO2作为溶剂,黄俊辉等[28]利用超临界CO2萃取技术提取了海带中的多不饱和脂肪酸,萃取的PUFA达67.2%。脂肪酸金属盐法利用不同脂肪酸的金属盐在有机溶剂中溶解度不同来分离,在有机溶剂中饱和脂肪酸金属盐的溶解度小于不饱和脂肪酸金属盐[29]。郑公铭等[30]利用脂肪酸金属盐法纯化EPA、DHA,通过结合尿素包合法纯化EPA、DHA含量达82.57%。银离子络合法依据多不饱和脂肪酸双键数目不同来分离,双键越多极性络合物所结合的银离子越多。刘卓华等[31]利用硝酸银络合法,富集了金枪鱼鱼油中EPA、DHA,浓缩产品中的EPA、DHA总质量分数达95.85%。对上述方法的总结,为皮诺敛酸的纯化提供参考,可采用多种方法相结合,以得到高纯度的皮诺敛酸。

2 皮诺敛酸的生理功能及应用

2.1 食欲抑制与体重控制

皮诺敛酸可以通过刺激人体分泌两种饥饿感抑制激素:胆囊收缩素(cholecystokinin,CCK)、胰高血糖素样肽(glucagon-like peptide-1,GLP-1),来达到抑制食欲的作用。负责CCK和GLP-1释放的TAG(TAG是形成皮诺敛酸的前体)的吸收与代谢是诱导饱腹感的必要条件。有研究表明PLA对肠道激素释放的影响很可能是通过乳糜微粒的形成来介导的[1]。链长超过12个碳原子的脂肪酸作为乳糜微粒被吸收到循环系统中,CCK信号通路与乳糜微粒的运输密切相关。因此,PLA影响乳糜微粒的形成或运输,从而影响CCK的释放。这种释放导致胃排空的延迟,进而导致饱腹感增加和食欲降低。另一方面,从远端小肠释放的PLA诱导的GLP-1在通过维持两餐间饱腹感来抑制餐后摄入方面可能对食欲的抑制作用更重要[32]。CCK与GLP-1不仅能帮助机体更好的消化脂肪,还能向大脑传递“饱腹感”信号,降低食欲,故有助于控制热量的摄取[32-34],达到减肥的效果。

2.2 血脂调节

PLA具有降脂作用,因此降低了患因血脂异常所导致的疾病风险。虽然其机制尚未完全揭示,但有研究者提出了一些假设。其中之一是PLA通过改变各种载脂蛋白基因的表达来发挥其降脂作用。载脂蛋白在脂质代谢中起关键作用:ApoA-Ⅰ和apoA-Ⅱ是HDL代谢的关键蛋白;ApoE对于清除脂蛋白残留是必需的;ApoC-Ⅲ是富含三酰甘油的脂质颗粒的主要成分,会干扰极低密度脂蛋白(VLDL)脂解和其细胞受体的摄入。皮诺敛酸可通过增加肝脏LDL吸收来降低血清中LDL的水平。另一种机制是PLA有助于降低三酰甘油水平的一些性质,原因有:减少从头脂质的合成;脂蛋白形成的底物利用率降低;VLDL物理化学性质发生变化。因此,补充PLA可能会降低三酰甘油和VLDL水平,表明其具有降低血液中高三酰甘油水平的作用[35]。Zhang等[9]证明了皮诺敛酸对油酸(OA)诱导的非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的作用及其与脂质代谢调节的关系。结果表明,用PLA处理可显著抑制HepG2细胞中脂质积累,氧化应激以及油酸诱导的炎症反应。PLA还显著降低了细胞三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的水平。PLA具有通过上调AMPK/SIRT1信号通路来防止OA诱导的HepG2细胞中脂质积累的作用。Lee等[8]将HepG2细胞在补充有50 μmol/L BSA(对照),棕榈酸、油酸、γ-亚麻酸、皮诺敛酸、α-亚麻酸、二十碳五烯酸(EPA)的无血清培养基中孵育24 h,证明了PLA通过减少与脂质合成,脂蛋白输入和脂肪生成途径调节有关的一些基因表达水平来下调肝细胞中的脂质合成代谢途径。Park等[36]研究表明摄入含有皮诺敛酸的松子油会导致高脂饮食(HFD)引起的肥胖症患者体内脂肪减少和降低肝组织的TAG水平。

2.3 胰岛素敏感性增强

胰岛素(insulin)为机体重要降糖激素,可促进葡萄糖氧化利用、促进脂肪蛋白质及肝糖原肌糖原合成,并抑制胰高血糖素分泌及肝糖原与脂肪分解,在血糖平衡与代谢稳态调控中发挥关键作用[37]。脂肪酸在许多组织中(如包括胰岛素反应性在内的组织),起到激活游离脂肪酸受体家族(FFA1、FFA2、FFA3和FFA4)的作用[38]。有研究表明,PLA作为FFA1和FFA4的配体具有很大的效力[10,39]。FFA1的激活导致胰岛β细胞对受葡萄糖刺激所产生胰岛素的分泌量增加[38,40],而FFA4的激活会增强机体对胰岛素的敏感性[41-42]。Christiansen等[10]证明,在给予PLA或PNO的小鼠中,葡萄糖暴露30 min后可观察到降血糖作用。由此得出PLA对FFA1和FFA4的共激活可以增强葡萄糖依赖性胰岛素的分泌并促进血糖降低。

2.4 抗炎作用

脂肪酸可以通过从细胞膜到细胞核的多种机制抵抗炎症反应。脂肪酸可以在细胞表面和细胞内受体起作用来控制炎症细胞信号传导和基因表达模式。炎性细胞膜脂肪酸组成的修饰可以改变膜的流动性、脂质筏的形成和细胞信号传导,从而改变基因表达,并且可以改变脂质和肽介体的产生。炎症细胞暴露于不同类型的脂肪酸中会影响其功能,因此脂肪酸具有改变炎症过程的潜力[43]。通过饮食摄入不同种类脂肪酸达到影响炎症介质(包括脂质和肽)的产生[44]。

有研究表明,在脂多糖(LPS)(一种刺激产生炎症的物质)刺激的鼠小胶质BV-2细胞中,PLA降低了一系列促炎介质的产生。用浓度为50 μmol/L的PLA培养细胞可使一氧化氮(NO)、白介素(IL)-6和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生分别减少41%、74%和27%。还观察到前列腺素E2(PGE2)的水平显著下降。当使用大鼠原发性腹膜巨噬细胞时,也观察到了类似的现象,用LPS刺激后,PLA降低了NO和PGE2(减少了35%)的产生[45]。同样,PLA降低了LPS刺激的鼠巨噬细胞RAW264.7的PGE2产生,PLA可改变细胞磷脂的脂肪酸谱,提高二十碳脂肪酸向二十二碳脂肪酸的延伸率[46],促进细胞膜脂肪酸结构组成的改变。

2.5 抑制癌症转移

癌症转移是由于癌细胞侵入周遭局部正常组织或通过体内循环系统、淋巴系统转移到身体其他部位。饮食中一些多不饱和脂肪酸可影响癌症转移。有研究表明,饮食中的脂肪与乳腺癌的发病率密切相关,并且某些饮食中的必需脂肪酸会影响乳腺癌的致癌作用[47-48]。

Chen等[49]研究了PLA对人乳腺癌细胞的作用。通过补充PLA,乳腺癌细胞的运动性和侵袭性降低了25%,但是未观察到对细胞增殖或细胞基质粘附的影响。用PLA孵育细胞会改变细胞的多不饱和脂肪酸(PUFA)组成,而对照组的细胞,花生四烯酸(AA)的百分比从12.6%降低至4.9%。由于AA水平降低,PGE2合成也受到影响(AA是PGE2的前体),因此证明了与PLA相关的PGE2产量呈剂量依赖性降低。由于PA显著降低了细胞PGE2的产生,因此该脂肪酸还可以调节乳腺癌细胞的增殖和转移。与PLA孵育后,这些细胞中COX-2的表达量也有所降低。这些研究表明,PLA可以降低细胞运动性和侵袭性。

3 展望

由于皮诺敛酸具有降脂、减肥、抗炎、抑制癌症转移等功能,广泛引起人们的关注,但皮诺敛酸仅存在于松子油中,限制了皮诺敛酸相关保健品的开发。对松子油中皮诺敛酸纯化方法的探索,可提高皮诺敛酸的产量,促进其工业应用。

多不饱和脂肪酸可通过微生物异源表达而提高产量,如EPA、DHA合成基因在裂殖壶菌中的异源表达。因此,研究皮诺敛酸的代谢途径,开发其相关基因在微生物中的异源表达,扩大其来源途径,将成为未来研究领域的一个重要方面。本文对皮诺敛酸的纯化方法及其生理功能进行综述,以期为皮诺敛酸开发为食品、保健品的功能性配料提供参考。