实验室检测技术在肺结核活动性判断中的应用进展

付亮 邓国防

我国肺结核疫情依旧严峻，是全球第二大结核病高负担国家，2018年新发肺结核患者82.3万例[1-2]。众所周知，结核分枝杆菌病原学检测阳性是诊断肺结核的金标准[3]，但目前我国仍存在大量病原学阴性(包括抗酸染色涂片、核酸检测、培养等方法)肺结核患者，因缺乏有效的生物学标志物，使得实验室检测技术难以对此类患者的活动性判断发挥有效作用，需要启动规范的活动性判断流程，即按照《肺结核活动性判断及临床应用专家共识》(以下简称“《共识》”)[4]对肺结核活动性判断的评价方法，包括应用症状评价、治疗史评价、实验室评价、影像学评价和病理学评价工具，以指导临床进行综合评价。但由于实验室检测技术具有方便快捷、体外检测、无机体损伤等优势，进一步评估及开发其在肺结核活动性判断上的意义仍然非常重要，并且将具有广泛的应用前景。基于此，笔者对国内外相关研究进行论述。

一、结核分枝杆菌病原学检测

目前，结核分枝杆菌病原学检测仍然是肺结核活动性判断最重要的评价指标。其中直接厚涂片、传统的分离培养和分子生物学检测是常用的痰结核分枝杆菌检测技术，而分子生物学技术因可明显提高活动性肺结核痰液病原学的检出率、获得接近50%的患者痰液病原学诊断而得以被更广泛地应用。但对于经上述检测结果为痰液病原学阴性肺结核患者，还可以通过支气管镜肺泡灌洗液(BALF)和超声内镜引导下的经支气管针吸活检(EBUS-TBNA)等深度病原学检测技术获得深部组织和分泌物，完成病原学检查，进一步提高病原学检出率以明确诊断，如GeneXpert MTB/RIF对支气管镜肺泡灌洗液检测较痰液具有较高的敏感度和特异度[5]。另外，随着病理学和分子病理学技术的推广和应用，应用荧光定量聚合酶链式反应技术检测石蜡组织中结核分枝杆菌脱氧核糖核酸(TB-DNA)，对提高肺结核活动性精准判断也起到了积极作用[6-7]。因此笔者建议，应充分应用上述检测技术的基础上努力寻找病原学证据。

二、结核分枝杆菌抗原检测

脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)是结核分枝杆菌重要的细胞壁组成成分，可作为靶抗原被侧向流式检测仪器(Alere Determine TB-LAM)在尿液标本中检测到，具有快速、价廉、无创、不需要实验室或技术支撑，以及能在床边开展等优点。LAM检测已被证明具有较高的准确度，主要适用于诊断CD4+T淋巴细胞计数水平低的HIV感染者是否并发结核病[8]，可提高此类患者的住院生存率[9]，已获得WHO[10]认可。有研究正在评估痰液LAM检测作为抗结核疗效监测的效果，其中酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)的方法取得了可喜的临床试验结果[11]。另一种有前途的方法是使用与质谱联用的纳米盘(NanoDisk-MS)鉴定结核分枝杆菌特异性肽片段，可以快速量化血液中结核分枝杆菌抗原；例如，可以快速检测出抗结核治疗后患者血清中培养滤液蛋白10(CFP-10)和早期分泌性抗原靶标6(ESAT-6)的下降水平[12]。但笔者认为，目前LAM检测仅是一种有前途的研究，能否作为肺结核活动性判断的评价指标仍需进一步临床验证。

三、炎性和急性期反应标志物

一系列活动性生物标记物可以用于诊断结核病和预测对抗结核药品治疗的反应，例如γ-干扰素(IFN-γ)诱导蛋白10(IFN-γ inducible protein 10，IP-10)[13]是多种细胞(包括单核细胞、内皮细胞和成纤维细胞)应答γ-干扰素而分泌的趋化因子，是单核/巨噬细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞和树突状细胞的趋化剂，可促进T淋巴细胞黏附[14-15]。有研究发现，活动性结核病患者血清中可溶性IP-10的浓度明显升高[16]，但在抗结核药品进行治疗后明显下降，提示IP-10可能作为活动性判定的指标。另外，IP-10对诊断免疫抑制者并发结核病方面具有一定的优势，可作为其诊断的辅助指标。C-反应蛋白(CRP)和血红细胞沉降率(ESR)已被应用于判断结核病的严重程度，预测治疗后的影像学改善情况[17-18]。也有研究把7种可溶性血清标志物(包括IP-10、CRP、IFN-γ、血清淀粉样蛋白A、补体因子H、载脂蛋白A1和甲状腺素转运蛋白)的相对水平作为一个整合的结核病诊断包[19-20]，用于区分结核潜伏感染和活动性结核病，但其应用价值还需进行多中心、大样本研究以进一步证实。因此，目前检测炎性和急性期反应标志物可作为活动性判断评价的参考指标，但临床价值仍然有限。

四、免疫学标志物检测

尽管尚未完全阐明机体在结核感染后的免疫应答机制，但免疫应答相关指标对于诊断疾病和预测疗效至关重要，尤其是T淋巴细胞的表型和功能性特征[21]。

1.T淋巴细胞表面标志物：T淋巴细胞经历了抗原驱动分化的若干阶段(早期、晚期和终末分化的效应细胞)，表现为一组细胞表面标志物的变化，这些标志物可作为结核分枝杆菌复制或抗原负荷的指标。例如，有研究发现，CD27、IFN-γ、CD4+T淋巴细胞的水平与肺部组织的破坏程度高度相关[22]。而T淋巴细胞活化标志物，如CD38、人白细胞抗原DR(HLA-DR)和细胞增殖抗原(Ki67)，也有希望成为结核病活动性判断的指标[21]。

2.T淋巴细胞反应标志物：γ-干扰素释放试验(interferon-gamma release assay，IGRA)检测的原理是结核感染者体内存在特异性效应T淋巴细胞，这些细胞再次受到结核抗原刺激时会分泌INF-γ。但IGRA与T淋巴细胞表面标志物相关检测的优劣还需要更多的研究证实。

与结核菌素皮肤试验(TST)相比较，IGRA与TST检测均可用于结核潜伏感染的判断[4]，但IGRA准确度高、假阳性少，且不受卡介苗和大多数非致病分枝杆菌的影响，尤其对于像中国这样普遍接种卡介苗的结核病高负担国家，IGRA具有更重要的意义。由于IGRA与TST检测均无法准确预测结核潜伏感染个体是否会发展为活动性结核病，故均不得用于活动性结核病的诊断[23]；近期，出现了应用IGRA评估抗结核疗效反应的研究，即从结核分枝杆菌特异性免疫应答的角度来评价抗结核疗效，此领域的研究数量正在迅速增加。研究表明，结核病患者初诊和治愈后的IFN-γ水平无明显差异[24-26]。但也有一些研究结果显示，活动性肺结核IFN-γ水平在抗结核药品进行治疗期间和治疗后可以出现下降或转阴，但也出现部分患者的免疫应答表现为持续上升的趋势[27-28]。Pourakbari等[29]对IGRA[包括γ-干扰素释放试验中的Quanti FERON-TB Gold In-Tube(QFT-GIT)、结核感染T淋巴细胞斑点试验(T-SPOT.TB)、结核感染T细胞检测试剂盒(QFT-Plus)等三种商业化检测技术]在评估抗结核治疗反应中的效果进行了系统综述和Meta分析，结果表明：在抗结核治疗期间监测QFT-GIT和T-SPOT.TB反应的变化可能对评估治疗效果十分有限，而QFT-Plus的变化则有希望用于确定治疗效果或进行治疗监测。还有研究关注了T-SPOT.TB中结核特异性抗原孔(TBAg)斑点形成细胞数与阳性对照孔植物血凝素(PHA)形成斑点数的比值(TBAg/PHA ratio)，发现活动性结核病患者的TBAg/PHA比值明显高于结核潜伏感染者，且在抗结核药品治疗过程中TBAg/PHA的比值会下降，提示该指标或可用于监测治疗效果[30]。综上，笔者认为目前IGRA在结核病活动性判断中价值有限，有待进一步研究。

五、血液转录标志物检测

Wang等[31]使用全基因组RNA测序方法，发现含肿瘤坏死因子受体超家族成员10C(TNFRSF 10C)、早期b细胞因子3(EBF 3)和a2-巨球蛋白样蛋白 1(A2ML 1)的三基因集可对91.5%的肺结核个体进行正确分类，可将活动性肺结核与结核潜伏感染者区分开，敏感度和特异度分别为82.4%和92.4%。还有研究表明，Ⅰ/Ⅱ型IFN基因或IFN刺激基因的mRNA转录的全血白细胞表达升高与活动性结核病有关；且在结核感染患者中发现了几种转录组特征性改变，并在抗结核药品治疗后下降[32]，提示这些标志物与结核病活动性相关。但这些检测技术还未能获得临床大量研究，临床意义有限，尚需进一步研究。

六、代谢组学检测

宿主代谢产物的来源包括：(1)外源性代谢产物来自外部环境，并通过呼吸吸入或物质摄入(例如食物或药物)。(2)体内产生的代谢产物可以是宿主生理代谢过程中的产物，也可以是微生物病原体代谢过程中的产物，或者是宿主对诸如感染或炎症等过程中的病理反应性产物[33]。因此，宿主或病原微生物的新陈代谢变化可能会影响代谢产物组分。不同微生物种属在人体组织微环境中生长代谢时产生的代谢产物种类不同，使得检测其代谢谱和特异性物质成为可能。目前，代谢组学检测的标本主要为血清、血浆、尿液、粪便[34]和呼出气[35]。在结核病诊断方面，有研究使用气相色谱与质谱联用的方法，鉴定健康人和患者呼出气中与结核病有关的挥发性有机化合物(volatile organic compounds，VOCs)，但其检测准确度较低(80%～85%)[36-37]。Nakhleh等[38]进行了一项病例对照研究，认为基于纳米材料的呼出气诊断方法可能是诊断结核病的有用工具(准确度为92%)，但仍需更大的队列研究以验证结果。可见，代谢组学检测目前不具备用于肺结核活动性判断的意义。

七、 展望

目前，病原学阴性肺结核活动性判断仍是临床医疗实践中的热点及难点问题，其评价指标主要包括实验室指标(结核分枝杆菌抗原、炎性和急性期反应标志物、免疫学指标、血液转录标志物等)、影像学指标(胸部X线、CT、MR、PET/CT)、病理学指标等。对于痰液病原学阴性的患者，推荐使用支气管镜下肺活检、BALF、分子生物学检测获得病理学和病原学诊断依据；如仍不能明确，可通过观察经验性抗结核药品治疗(一般2个月疗程)效果来评价其活动性。其中实验室指标是最重要的评价依据，因此笔者结合相关文献评价了实验室检测技术用于肺结核活动性判断的临床应用价值和前景，为临床医生提供了基本评价原则和方向。但仍有许多问题亟待解决：一是研发高效的生物标志物应用于肺结核活动性判断，不断提升其判断准确度。二是开展活动性肺结核的临床转归随机对照研究，探索科学的实验室检测技术在活动性判断体系中的评价作用。三是肺结核患者的并发症、残留损坏和结构性肺病也不容忽视，不仅可影响肺结核活动性的判断，还可能影响实验室检测技术的敏感度和特异度。总之，在肺结核活动性判断中需应用多种实验室检测技术综合评估，才能解决患者精准治疗和精准停药的临床问题。