BRAF V600E基因突变在结直肠癌治疗中的研究进展

2020-01-07张祥涛刘睿清张宪祥卢云

中华结直肠疾病电子杂志 2020年3期

张祥涛刘睿清张宪祥卢云

结直肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一。其中，V-raf鼠肉瘤毒癌基因同源体B（V-raf murine sarcoma viral oncogene homolog，BRAF）V600E突变的结直肠癌是一种独特的结直肠癌分子亚型，具有特殊的分子和临床病理特征，恶性程度高且缺乏有效的治疗手段，患者预后极差。BRAF V600E基因突变还常见于恶性黑色素瘤、甲状腺乳头状癌等。既往研究聚焦于通过阻断关键激酶BRAF和MEK活性抑制信号通路，尽管针对这些靶点的靶向药物在黑色素瘤临床治疗中取得了显著疗效，但也面临单药治疗快速耐药的问题，其结果是肿瘤细胞通过各种机制重新激活MAPK信号通路[1-3]。而BRAF V600E结直肠癌患者中BRAF V600E和MEK靶向药物单药和联合使用疗效远不及黑色素瘤[4-5]。本文将重点讨论BRAF V600E基因突变在结直肠癌诊治中的最新进展。

一、BRAF基因突变与结直肠癌演进

1.结直肠癌分子遗传学改变与BRAF基因突变

结直肠癌是通过多种遗传和表观遗传途径发展的，主要有三条途径：染色体不稳定（chromosomal instability，CIN）、微卫星不稳定（microsatellite instability，MSI）以及CpG岛甲基化表型（CpG island methylator phenotype，CIMP）等途径[6-8]。这些途径均具有特定的病理特征、致癌机制和肿瘤发生发展过程。这些通路的分子方面已被临床用于结直肠癌的诊断、筛选和管理。

Lengauer等[9]在非整倍体肿瘤细胞中首次证实CIN的存在。CIN指的是DNA片段受到缺失或扩增事件影响的拷贝数畸变（CNA）的获得率[10]。它存在于绝大多数结直肠癌中（约70%）[11]，可导致APC、TP53等抑癌基因和KRAS等癌基因发生一些有害突变[12-13]，所以它和结直肠癌的复发风险、转移风险[14]及存活率[15]等密切相关。CIN在BRAF野生型的传统腺瘤中发生，并通过“传统途径”向恶性进展。

微卫星不稳定性（microsatellite stability，MSI）是由于DNA错配修复（mismatch-repair，MMR）基因的种系/体细胞突变导致的DNA错配修复系统缺陷。MSI肿瘤的发生受错配修复基因失活的驱动，错配修复基因通过修复DNA复制错误、抑制非相同DNA序列的重组以及干扰对DNA损伤的反应，在揭示遗传稳定性方面发挥着关键作用。DNA-MMR系统包括四种众所周知的蛋白质：MLH1、MSH2、PMS2和MSH6，它们作为异质二聚体相互作用[16]。

在结直肠癌中，MSI检测分为微卫星高度不稳定性（MSI-H）、微卫星低度不稳定性（MSI-L）和微卫星稳定性（MSS）。MSI约占所有结直肠癌肿瘤的8%～20%，Ⅱ期（20%）比Ⅲ期（12%）和Ⅳ期（4%）更常见[11，17]。近年来，很多学者研究表明BRAF基因突变与MSI影响结直肠癌患者的预后。Sinicrope等[18]研究发现MSI结直肠癌比MSS-结直肠癌具有更好的预后和更少的转移。其他研究也表明，与MSS/MSI-L结直肠癌患者相比，Ⅱ期病理肿瘤的MSI-H结直肠癌患者预后更好，复发风险更低[19]。BRAF突变型/MSI癌症预后良好，其次是BRAF野生型/MSS癌症，而BRAF突变型/MSS癌症的预后非常差[20-21]，但分子机制仍不清楚。Bond等[22]研究发现在BRAF突变型/MSS癌症中存在明显的高水平CIN，且这种类型越接近晚期，总CIN水平升高越显著。不同的是BRAF野生型/MSS癌在早期和晚期的CIN发生率相当。该研究还发现BRAF突变型/MSS癌与BRAF野生型/MSS癌的p53突变率相当，明显高于BRAF突变型/MSI癌的p53突变率。这可能是该类型癌症预后差的原因。Koinuma等[23]研究证实BRAF突变癌主要发生在近端结肠。Bond等[22]同样证实大部分BRAF突变型/MSS的癌症来自该区域（约69%），但近端癌与远端癌的CIN发生率无差异。Sérgia等[24]研究发现在结直肠癌中MSI组BRAF突变率明显高于MSS组（分别为28%和7.5%）。研究还显示MSI结直肠癌比MSS结直肠癌更容易发生BRAF V600E基因突变[25-26]。

Toyota等[27]解释了CpG岛甲基化表型（CIMP）是另一种致瘤途径。CpG岛是指CpG二核苷酸聚集区域。在活化基因的5′非编码区启动子内，CpG岛都是去甲基化状态[28]。启动子区CpG岛（亦称5′CpG岛）甲基化将直接或间接地抑制转录，所以它可以抑制下游基因表达。结肠直肠癌中的CIMP可能通过一种独特的途径发生，这种途径起源于某些亚型的锯齿状息肉[29]，在所有结肠直肠癌病例中约有15%的CIMP存在[30-31]。Weisenberger等[32]发现CIMP阳性（CIMP＋）肿瘤包含大部分情况下的肿瘤BRAF突变。偶见的错配修复缺陷几乎完全是由于CIPM相关的MLH1甲基化所致。依据CIPM在BRAF基因突变锯齿状腺瘤中的表达，将腺瘤分为的3个组：高CpG岛甲基化表型（CIMP-1）、低CpG岛甲基化表型（CIMP-2）和非CIMP分组，3个组在结直肠癌中的突变率分别为77%、18%和0（P＜0.0001）[33]。说明BRAF基因突变和CpG岛甲基化有关。一些研究发现BARF V600E基因发生突变，可以使细胞对凋亡刺激产生抵抗，使得MLH1基因启动子CpG岛发生甲基化，而使细胞发生MSI[34-35]。Bond等[22]在BRAF突变体/MSS癌症中，CIN和CIMP同时出现的频率很高（72%）。

2.BRAF基因突变及MAPK信号通路

RAS/MAPK通路与磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/AKT通路共同构成了参与癌症发生的基因转录的连续磷酸化级联反应后最著名的信号传递通路之一。MAPK/ERK信号级联将有丝分裂和其他刺激信号从细胞膜上的受体（如EGFR）传递到细胞核。细胞表面受体下游的Ras小胍三磷酸酶（GTPase）激活丝氨酸/苏氨酸激酶蛋白RAF家族，导致MAPK和ERK激酶（MEK）蛋白磷酸化和活化，随后磷酸化并激活ERK蛋白。ERK蛋白激活后磷酸化多种底物，包括多种转录因子，并调控细胞增殖、迁移、血管生成和抑制凋亡等几个关键的细胞活动[36]。RAF家族还包括ARAF和CRAF，但BRAF具有最强的基础激酶活性，是MEK/ERK蛋白最有效的激活剂。

MAPK/ERK信号通路的异常激活参与了许多人类恶性肿瘤[37]。在实体肿瘤中，BRAF突变的发生率最高，V600E替代约占突变的80%，与野生型蛋白相比，BRAF中的所有突变都具有更高的激酶活性，从而刺激MAPK/ERK活性。

3.BRAF基因突变与KRAS基因突变的相关性研究

RAS基因家族包括HRAS、KRAS、NRAS，人类表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）级联反应与KRAS基因突变相关[38]。BRAF基因是KRAS基因的下游作用因子，同属RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK通路[39]。CIMP-1类结直肠癌主要与BRAF基因突变相关（通常为BRAF V600E）。CIMP-2类结直肠癌主要与KRAS基因突变相关[40]。KRAS和BRAF基因突变互相排斥的关系在肺癌中也有类似的报道[41]。

宋敏等[42]研究表明KRAS基因突变与结直肠癌患者的年龄、发病部位及肝转移有关，BRAF基因突变与性别、分化程度、肿瘤TNM分期有关。与肿块大小、肿瘤病理形态、淋巴结转移、脉管浸润等临床病理特征无相关性。

二、BRAF V600E突变结直肠癌的治疗

1.有关针对BRAF基因及下游作用因子的靶向治疗

近年来，随着精准医疗的发展，靶向治疗已经成为治疗结直肠癌的有效手段。目前EGFR基因是临床上治疗结直肠癌的主要靶点之一，但由于BRAF基因突变，导致出现抗EGFR药物抵抗。EGFR靶向抑制剂帕尼单抗和西妥昔单抗对于BRAF V600E突变型结直肠癌患者治疗效果差，且预后不良，中位生存期仅为6～9个月[43]。而BRAF V600E突变型黑色素瘤患者对靶向抑制BRAF或联合其下游效应器MEK抑制剂治疗效果明显，可获得高达80%的有效率[44-45]。BRAF突变型的黑色素瘤对BRAF抑制剂维罗非尼的有效率为60%[46]。而转移性BRAF突变型结直肠癌患者的临床研究显示，维罗非尼单药治疗时无临床获益[47]。研究发现与结直肠癌相比，黑色素瘤细胞不是上皮细胞，通常不表达表皮生长因子。BRAF V600E结直肠癌对单药BRAF抑制缺乏应答，被推测至少部分原因是EGFR的反馈激活导致MAPK信号通路重新激活。

BRAF突变结直肠癌的应答需要强有力的MAPK通路抑制，Corcoran等[48]研究发现，双重MAPK通路阻断BRAF抑制剂达拉法尼和MEK抑制剂曲米替尼可以导致BRAF突变结直肠癌患者的临床获益。尽管其他信号通路可能在本病中发挥重要作用，但这些数据表明，有效抑制MAPK信号通路在BRAF突变的结直肠癌中是至关重要的，需要能够实现更好的MAPK抑制的治疗策略。Kopetz等[49]研究表明：BRAF V600E抑制剂联合伊立替康及西妥昔单抗治疗相较单纯使用伊立替康联合西妥昔单抗治疗的无进展生存时间有显著的延长，由2个月提高至4.4个月。Kopetz等[50]研究发现将三联体方案与双联体方案进行比较的总体存活率分析，显示三联体方案的死亡率风险比为0.79。不良事件发生率三联疗法组与双联疗法组相似，3级及以上毒副作用发生频率对照组略高于两组。作为三联疗法的一部分，比尼梅替尼的加入增加了一些与MEK抑制相关的附加毒性作用。三组和双组的停药率和相对剂量强度相似。虽然三联治疗具有BRAF V600E突变的转移性结直肠癌患者，其总体生存期明显长于标准治疗。但BRAF V600E突变的结直肠癌的治疗还需进一步研究。

2.BRAF突变晚期结直肠癌的免疫治疗

目前的研究结果表明，MSI状态下的结直肠癌预后较好。Le等[51]的研究表明MSI状态可以指导患者进行免疫治疗，即PD-1抑制剂可以明显改善MSI-H状态患者的预后。程序性死亡受体-1（programmed death receptor-1，PD-1）抑制剂纳武单抗（nivolumab）现已被美国FDA批准应用于各类表现为MSI-H的恶性肿瘤。BRAF-mt结直肠癌患者中约20%患者同时存在MSI-H表型，这部分患者或许能从抗PD-1/PDL1治疗中受益。