白芨假鳞茎芽无菌苗高效增殖影响因子初步筛研究

陈小艺，陈俊，杨之帆

(1.湖北大学生命科学学院，湖北 武汉 430062；2.武汉科技大学化学工程与技术学院，湖北 武汉 430081)

0 引言

本实验采用白芨无菌苗为材料，以白芨假鳞茎芽为外植体，通过研究不同外源添加物、接种密度、活性炭浓度、切割手法、切割手法与密度等，对白芨假鳞茎芽无菌苗增殖的关键技术进行研究. 以期为建立白芨试管苗高效稳定的快繁体系，为白芨的工厂化生产提供理论依据和技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料由湖北大学陈永勤实验室提供的白芨无菌瓶苗(切取假鳞茎).

1.2 不同外源添加物对白芨假鳞茎增殖的影响试验以MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+琼脂7.0 g/L为基础培养基，分别添加香蕉泥、土豆汁、番茄汁，调 pH5.8，培养4周后通过观察其生长情况并记录数据算出其增殖系数a. 为探究不同外源物质对白芨假鳞茎芽增殖的影响，试验设计因素见表1.

1.3 接种密度对白芨假鳞茎增殖的影响试验以MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+琼脂7.0 g/L+蔗糖30 g/L为基础培养基，调pH5.8，分别以密度为4个、6个、8个，接种后4周统计结果计算出增殖系数从而探究密度对白芨芽增殖系数的影响.每一处理接种6瓶作为重复.

1.4 活性炭浓度对白芨假鳞茎增殖的影响试验基础培养基为MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+琼脂7.0 g/L+蔗糖30 g/L，添加活性炭，添加量为：3.75 g/L、6.25 g/L、8.75 g/L、11.25 g/L，调pH5.8，以不添加活性炭为对照，接种后每周统计数据算出增殖系数a. 试验设计因素水平见表2.

表1 外源添加物对白芨假鳞茎增殖影响试验设计

表2 活性炭浓度对白芨假鳞茎增殖的影响试验设计

1.5 切割手法对白芨假鳞茎增殖的影响试验以MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+琼脂7.0 g/L+蔗糖30 g/L为基础培养基，无菌条件下取出瓶苗，切取假鳞茎，再将切取的假鳞茎分别以从中间纵切一刀、纵切两刀、横切一刀、 横切一刀不切断、两对角切取来处理，4周后观察结果统计数据算出增殖系数a，比较切割手法对白芨假鳞茎增殖效果的影响.每一处理接种6瓶作为重复.

1.6 切割手法与密度对白芨假鳞茎增殖的影响试验以MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+琼脂7.0 g/L+蔗糖30 g/L为基础培养基，无菌条件下取出瓶苗，切取假鳞茎，假鳞茎均以密度为4分别按上述手法进行接种，每周后观察结果统计数据算出增殖系数a，比较切割手法与密度组合对白芨假鳞茎增殖效果的影响.

2 结果与分析

2.1 外源天然物质对白芨增殖系数的影响以不添加外源天然物质的培养基作为对照组，研究不同外源物质对白芨增殖效果的影响.白芨无菌假鳞茎接入培养基后每周观察结果，如图1、表3所示为接种90 d后的实验结果.

图1 不同情况下白芨假鳞茎芽无菌苗增殖情况

表3 白芨无菌增值系数统计

由表3可见：白芨假鳞茎在香蕉养基中芽的增殖系数为3，最大，所以白芨最佳外源添加物为香蕉.

2.2 接种密度对白芨增殖系数的影响不同接种密度，会影响培养基中白芨代谢产物的含量，因此可能会对白芨增殖产生一定的影响，如表4所示为接种90 d后的实验结果.

表4 白芨无菌苗增殖系数统计

由表4可见，接种密度为4或6的时候增殖系数分别为3.294，3.238，但是在接种密度为6时白芨的生长情况最好，所以最适接种密度为6.

2.3 活性炭对白芨增殖系数的影响活性炭具有吸附，在兰科植物组培中使用较多，而不同浓度的活性炭也会对白芨增殖产生影响，如表5所示为接种75 d后的实验结果.

表5 白芨无菌苗增殖系数统计

由表5可见，白芨在活性炭浓度为3 g/L时，增殖系数为4.107最高，且生长情况最佳，所以白芨假鳞茎增殖培养基中活性炭浓度最适为3 g/L.

2.4 切割手法对白芨增殖系数的影响切割手法可能会影响白芨的增殖，接种密度为2时，以不同切割手法对白芨假鳞茎进行处理，如表6所示为接种45 d后的实验结果.

表6 白芨无菌苗增殖系数统计

由表4可见，当交叉相切时，增殖系数为3.167最高，所以最佳的切割手法为交叉相切.

2.5 切割手法与接种密度对白芨增殖系数的影响切割手法与接种密度相互作用可能会对白芨增殖有更大的作用，如表7所示为接种30 d后的实验结果.

表7 白芨无菌苗增殖系数统计

由表6和表7可见，白芨假鳞茎在接种密度为4，切割手法为中间横划一刀时增殖系数最高，所以白芨假鳞茎增殖时，切割手法为中间横划一刀，接种密度为4时为最佳.

3 小结与讨论

外源物质对白芨假鳞茎芽的增殖有较大影响.选择合适的外源物质及其浓度可以显著增加白芨假鳞茎的增殖系数. 香蕉泥、马铃薯提取液是兰科植物组培中常用的添加物，富含多种营养物质，可以促进植物细胞的增殖与生长[16]. 在本研究中，通过不同外源物在MS+BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+琼脂7.0 g/L基础培养基中对白芨假鳞茎的增殖系数进行系统比较，结果表明，在添加适量香蕉泥的基础培养基中白芨假鳞茎的增殖系数为3，数值最大. 所以在番茄汁、香蕉泥、马铃薯提取液这3种外源物质中，适宜量的香蕉泥是白芨最佳外源添加物.

此外，接种密度对白及假鳞茎芽的增殖也有一定影响.接种密度为4、6、8三个水平时.接种密度为4和6的增殖系数相当，但在接种密度为6时白芨的生长情况最好，所以白芨的最适接种密度为6. 在同一个接种瓶中，如果接种过密会增加接种时间、提高污染率，并可能导致培养基营养供应不足，最后增殖系数也不高. 如果接种过于稀疏，又会增加接种瓶数，也可能会造成培养基营养利用率不高. 因而选择合适的接种密度，对提高增殖系数、培养基利用率至关重要.

活性炭浓度对白芨假鳞茎的增殖也有影响. 在基础培养基中添加不同浓度的活性炭，以不添加活性炭为对照.通过实验可得在活性炭浓度为3 g/L时，增殖系数最高，且生长情况最佳. 活性炭有吸附作用，可以有效防止白芨假鳞茎芽增殖过程中的褐化，以及毒素的累积、培养基中可能出现的高盐毒害等不利因素，活性炭还能吸附琼脂中所含的杂质以及蔗糖在高压下消毒产生的 5-羟甲基糠醛[17]. 但活性炭浓度有一个最适宜浓度，本研究，通过实验手段比较分析出活性炭的最适宜浓度.

最后本实验还探究了切割手法与接种密度对白芨假鳞茎芽增殖系数的影响，通过实验可得白芨假鳞茎在接种密度为4，切割手法为中间横划一刀时增殖系数最高. 切割手法和接种密度在植物组织培养中常常被人们忽略，但有时只是一个不同的手法和简单的处理，可能会使实验的结果发生很大改变，因而本实验意在从这些细微的方面来探究其影响结果，有着重要的意义.

白芨种子细小，自然条件下需要与共生菌共生才能萌发[15]，传统的分生繁殖难以在短时间内得到性状稳定、整齐的优质种苗[19]，快速繁殖技术规模化生产白芨种苗是缓解白芨资源紧缺的有效方式之一[20].白芨快速繁殖和工厂化生产提供了技术支持.