阿托伐他汀通过调控张力蛋白同源第10染色体丢失的磷酸酶基因/蛋白激酶B通路减少猪冠状动脉微栓塞后心肌细胞的凋亡

陈涵 王琛 张龙岩 鄢华 苏晞 王江友

冠状动脉微栓塞（coronary microembolization，CME）是急性冠状动脉综合征及介入治疗围术期常见并发症，主要由于医源性或自发冠状动脉粥样斑块破裂及腐蚀所导致［1］。有研究显示，CME发生与冠状动脉无复流/慢血流存在直接相关，进而导致心肌损伤及近远期心功能明显下降，即使心外膜血流恢复正常，心功能依然进行性下降［2］。一旦发生CME，目前包括药物及器械相关保护措施均不能改善患者近远期临床预后［3］。因此，经皮冠状动脉介入治疗（percutaneous coronary intervention，PCI）围术期CME所致并发症仍是临床医师所面临的难题。

既往本课题组动物试验发现，CME发生后，局部心肌将发生微小面积坏死灶，周边心肌细胞出现大范围凋亡现象，心功能呈现进行性恶化的现象［4］。半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3（cysteine containing aspartate specific protease，Caspase-3）是细胞凋亡通路中至关重要的蛋白，也是促细胞凋亡的主要效应因子及最关键的凋亡执行者。既往动物试验发现，CME发生后，在微梗死灶周围，发现有大量心肌细胞凋亡，证实其中的机制可能是CME诱发心肌细胞发生凋亡，增加心肌组织Caspase-3蛋白表达，进而导致心肌损伤及收缩功能恶化，且通过抑制Caspase-3蛋白表达，能够降低心肌细胞的凋亡，明显改善心脏功能，这进一步证实了CME致心功能不全发生机制与Caspase-3介导的细胞凋亡密切相关［5-8］。

张力蛋白同源第10染色体丢失的磷酸酶基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）是最常见的肿瘤抑制突变基因，参与调控细胞的正常发育过程，包括细胞的生长、粘连、迁移、侵袭和凋亡［9］。有研究表明，PTEN能够在各种刺激下加快各类细胞发生凋亡［10］。既往本课题组研究发现，在猪CME模型中抑制PTEN/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）通路，降低促凋亡蛋白Caspase-3的表达，从而抑制心肌细胞凋亡，改善心功能［5］。另外，本课题组研究亦证实，阿托伐他汀能够降低促凋亡蛋白Caspase-3的表达，抑制心肌细胞凋亡，改善心功能［6］。阿托伐他汀除了具有降低胆固醇作用外，还具有多种心血管益处，包括抗炎和抗细胞凋亡。近年来，许多研究进一步验证了其在心肌缺血再灌注损伤、冠状动脉粥样硬化、心肌梗死和肾缺血再灌注损伤动物模型中的抗细胞凋亡作用［11-14］。本研究设想，是否能够使用阿托伐他汀预处理，降低CME后心肌细胞凋亡，并且阐明其主要通过抑制调控PTEN/Akt通路，降低Caspase-3表达来实现？另外，前期动物试验显示，CME后12 h心肌细胞凋亡达到高峰［4］。因此本研究以在成功建立CME模型后12 h作为研究观察时间，进行各组实验动物指标的对比研究。

1 材料与方法

1.1 动物分组

12 周龄健康小型猪15头，雌雄不限，体重21～25 kg，随机分为假手术组、CME组、CME＋阿托伐他汀组［CME建立前阿托伐他汀预处理（连续服用7 d，每日20 mg，CME前负荷80 mg］，每组5头。

1.2 CME模型建立

CME模型的建立将参考既往研究团队建立的标准［4］。首先肌内注射氯胺酮首剂麻醉，手术过程中给予地西泮静脉（耳缘静脉）维持麻醉状态，采用外科方式皮肤切口，逐步分流出右侧股动脉血管，穿刺置入7 F股动脉鞘管，注射肝素达到肝素化（200 U/kg），手术＞1 h追加1次肝素（100 U/kg）。采用PCI法，操控指引导丝将微导管送至左前降支中段（第一对角支发出处），之后缓慢注入42 μm的微栓塞球45 ml，在30～40 min内注射完毕。

1.3 超声心动图检测

建模前及成功建立CME模型后12 h使用超声心动图检测各组猪左心室射血分数（left ventricular ejection fraction，LVEF）、左心室舒张末期内径（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室短轴缩短率（lef t ventricular f raction shortening，LVFS）及心输出量（cardiac output，CO）。所有指标由具有超声心动图经验的医师测量及计算。

1.4 心肌梗死面积测量

超声心动图检测后处死动物，取出相应部位心肌组织，按照苏木精碱性品红苦味酸（hematoxylin basic fuchsin picric，HBFP）染色步骤操作，每张病理切片随机选取5个视野（放大100倍），测量梗死区域，梗死面积比例由占总切片的面积百分比获得。

1.5 心肌细胞TUNEL染色

DNA末端TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）检测心肌细胞凋亡，并进行半定量分析，按照试剂说明书进行操作；随机观察切片上5个400倍高倍视野，计数细胞核总数和凋亡心肌细胞，计算凋亡比例。

1.6 Western blot检测蛋白的表达

将心肌组织匀浆化，并使用等分试样进行测定，使用洗涤剂相容性测定法测定每个样品的蛋白质浓度。将蛋白质样品（100 μg）加载到聚丙烯酰胺凝胶上电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。然后封闭硝酸纤维素膜，4℃与一抗孵育过夜。 兔抗PTEN，兔抗Akt、p-Akt（磷酸化位点苏氨酸-308）和兔抗Caspase-3及cleaved-Caspase-3购自Abcam公司。Western blot是用二抗在室温下处理1 h，然后暴露于X线胶片。 扫描X线胶片，通过Bio-Rad图像分析（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）测定光密度。

1.7 肌钙蛋白I测定

建模前及成功建立CME模型后12 h检测各组猪血浆肌钙蛋白I水平，采用免疫化学发光法测定，严格按照试剂说明书操作。

1.8 统计学分析

所有数据采用SPSS 17.0统计软件进行处理。计量资料以（）表示，采用t检验。计数资料以百分率表示，采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组心功能指标比较

CME组术后12 h LVFS［（26.42±2.63）%比（42.83±2.35）%］、LVEF［（51.34±4.23）%比（66.78±3.98）%］、CO［（2.62±0.38）L/min比（4.25±0.58）L/min］与假手术组比较，呈现显著下降，而LVEDD与假手术组比较，明显增加［（40.95±1.39）mm比（32.68±1.85）mm］，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。CME＋阿托伐他汀组LVEF［（58.32±5.38）%比（51.34±4.23）%］、LVFS［（32.35±3.86）%比（26.42±2.63）%］、CO ［（3.50±0.47）L/min比（2.62±0.38）L/min］与CME 组比较，呈现升高趋势，LVEDD与CME 组比较，呈现降低趋势［（34.82±1.69）mm比（40.95±1.39）mm］，差异均有统计学意义（均P＜0.05，表1）。

2.2 各组肌钙蛋白I比较

CM E组术后12 h 肌钙蛋白I与假手术组比较，明显升高［（0.325±0.189）ng/ml 比（0.062±0.012）ng/ml，P=0.023］；CME＋阿托伐他汀组肌钙蛋白I与CME组比较，有下降趋势［（0.142±0.095）ng/ml比（0.325±0.189）ng/ml，P=0.035］，差异均有统计学意义。

2.3 CME 病理学改变

HE染色显示微梗死灶内心肌细胞核消失或溶解，细胞胞浆呈红染，梗死灶周边细胞变性、水肿，周围炎性细胞大量浸润及红细胞渗出（图1 A～B）。HBFP染色发现，假手术组未见明显心肌微梗死灶；CME组和CME＋阿托伐他汀组均可见多处心肌微梗死灶，呈局灶性分布，非透壁性，以内膜下和左心室多见（图1 C～D）。CME＋阿托伐他汀组梗死面积比例明显低于CME组［（6.38±3.89）%比（10.28±5.69）%，P=0.027］。

表1 CME 术后12 h 心功能指标的变化（n=5，）

表1 CME 术后12 h 心功能指标的变化（n=5，）

注：a，与假手术组比较，P ＜0.05；b，与CME 组比较，P ＜0.05；CME，冠状动脉微栓塞；LVEF，左心室射血分数；LVEDD，左心室舒张末期内径；LVFS，左心室短轴缩短率；CO，心输出量

项目 假手术组 CME 组 CME ＋阿托伐他汀组LVEF （%） 66.78±3.98 51.34±4.23a 58.32±5.38ab LVFS （%） 42.83±2.35 26.42±2.63a 32.35±3.86ab LVEDD （mm） 32.68±1.85 40.95±1.39a 34.82±1.69ab CO （L/min） 4.25±0.58 2.62±0.38a 3.50±0.47ab

2.4 各组实验动物心肌细胞凋亡改变

凋亡心肌细胞TUNEL染色细胞核呈棕黄色，正常细胞核呈淡蓝色。CME后心肌细胞凋亡主要存在于微梗死灶及其周围，假手术组偶见心肌细胞凋亡存在于心内膜下与乳头肌处（图2）。CME组心肌细胞凋亡比例与假手术组比较明显增加［（12.98±5.69）%比（0.15±0.10）%，P=0.038］；CME＋阿托伐他汀组心肌细胞凋亡比例与CME组比较明显减少［（7.89±4.26）%比（12.98±5.69）%，P=0.048］，差异均有统计学意义。

图 1 HE染色及HBFP染色图 A.假手术组心肌组织HE染色，未见明显异常；B.CME术后12 h微梗死相关区域HE染色（箭头所示为微动脉内的微栓塞球，×400）；C.CME＋阿托伐他汀组心室前壁心肌组织微梗死相关区域HE染色（箭头所示为微动脉内的微栓塞球，×200），梗死程度及炎症浸润幅度明显少于CME组。D.假手术组心肌组织HBFP染色，未见明显心肌坏死染色；E.CME术后12 h微梗死灶区域HBFP染色（粗箭头示微梗死灶染成红色，细箭头示微栓塞球，×100）；F.CME＋阿托伐他汀组心室前壁心肌组织微梗死相关区域HBFP染色（粗箭头示微梗死灶染成红色，细箭头示微栓塞球，×100），梗死面积明显少于CME组

图 2 心肌细胞凋亡TUNEL染色图 A.假手术组心肌组织TUNEL染色，可见散在细胞凋亡（箭头示心肌细胞凋亡染成棕黄色，×200）；B.CME组术后12 h微梗死灶区域TUNEL染色（箭头示心肌细胞凋亡染成棕黄色，×200）；C.CME＋阿托伐他汀组心室前壁心肌组织微梗死相关区域TUNEL染色（箭头示心肌细胞凋亡染成棕黄色，×200），心肌细胞凋亡明显少于CME组

2.5 心肌组织蛋白的表达

Western blot定量分析显示，CME组心肌细胞PTNE表达与假手术组比较，明显升高［（0.86±0.35）%比（0.25±0.12）%，P=0.034］；p-Akt表达与假手术组比较，明显下降［（0.37±0.15）% 比（0.92±0.27）%，P=0.032］；cleaved-Caspase-3含量与假手术组比较，显著增加［（1.12±0.42）% 比（0.21±0.13）%，P=0.025］，差异均有统计学意义。CME＋阿托伐他汀组p-Akt表达与CME组比较，显著增加［（0.82±0.25）%比（0.37±0.15）%，P=0.033］；cleaved-Caspase-3含量与CME组比较，显著下降［（0.58±0.35）% 比（1.12±0.42）%，P=0.042］（图3）。

3 讨论

动物实验发现，向犬的冠状动脉内注入微栓塞球，犬的冠状动脉血流短暂减少后即刻可恢复正常，但心肌的收缩功能呈现进行性的下降现象，表明CME致心肌损伤的机制并非由心外膜血管血流减少所决定［15］。本课题组既往动物实验发现，微栓塞所致的坏死心肌的面积占总心肌面积不到5%，微栓塞所致心肌细胞坏死不足以完全解释心肌收缩功能障碍［4-8，16］。

图 3 心肌细胞蛋白表达图 A～C.PTEN、p-Akt、Akt、cleaved-Caspase-3及Caspase-3 Western blot图；D.PTEN蛋白统计结果；E.p-Akt蛋白统计结果；F.Akt蛋白统计结果；G.cleaved-Caspase-3蛋白统计结果；H.Caspase-3蛋白统计结果；a，与假手术组比较，P＜0.05；b，与CME组比较，P＜0.05

抑癌基因PTEN于1997年首次被报道之后即成为研究热点。PTEN是迄今发现的第一个具有双特异磷酸酶活性的抑癌基因，也是继p53基因后另一个较为广泛地与肿瘤发生关系密切的基因。PTEN蛋白在细胞生长、凋亡、黏附、迁移、浸润等方面具有重要作用［9］。有研究发现，PTEN能够被多种刺激因子激活，从而针对各类细胞发挥促凋亡作用［10］。目前越来越多的证据显示PTEN是多种心血管疾病的发生发展中的关键调控因子，PTEN广泛表达于血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞和纤维细胞，通过调控下游通路磷脂酰肌醇3-激酶/Akt参与调控细胞的肥大、心肌收缩力、细胞的成活及凋亡和细胞代谢［17］。在心肌缺血再灌注损伤研究中发现，PTEN高表达于心肌组织，与心肌细胞的凋亡发生存在密切关联，抑制PTEN的表达，能够减少心肌细胞发生凋亡，改善心功能［18］。也有研究肝缺血再灌注损伤，亦发现PTEN参与肝细胞凋亡，加重肝功能的恶化，抑制PTEN的表达，可逆转此现象［19］。既往本课题组研究发现，在猪CME模型中抑制PTEN/Akt通路，可降低促凋亡蛋白Caspase-3的表达，从而抑制心肌细胞凋亡，改善心功能［5］。

阿托伐他汀除了具有降低胆固醇作用外，还具有多种心血管益处，包括抗炎和抗细胞凋亡。近年来，许多研究进一步验证了其在心肌缺血再灌注损伤动物模型［11］、冠状动脉粥样硬化［12］、心肌梗死［13］和肾缺血再灌注损伤［14］中的抗细胞凋亡作用。越来越多的研究表明，阿托伐他汀可能调节PTEN/Akt细胞信号通路，尽管他汀类药物在不同的病理条件下可能具有不同的调节作用。Miraglia等［20］证明他汀类药物可促进肿瘤细胞中PTEN蛋白的表达，抑制磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路的激活，从而发挥抗肿瘤作用。然而，Wu等［21］发现阿托伐他汀可以抑制心脏黏液瘤细胞的生长，主要是通过促进黏液瘤细胞中PTEN蛋白的表达。实际上，PTEN/Akt信号通路在缺血再灌注损伤的发病机制中起着重要的内源性心脏保护作用［22-23］，阿托伐他汀可抑制PTEN蛋白的表达，增强Akt信号通路的激活［24］。鉴于上述发现，本研究提出在CME动物中预处理阿托伐他汀可通过调节PTEN/Akt通路减弱心肌细胞凋亡来预防CME相关的心肌功能障碍。本研究发现阿托伐他汀预处理可以通过抑制心肌细胞凋亡来减少CME诱导的心肌损伤。此外，本研究表明PTEN/Akt通路的调节似乎是阿托伐他汀的心脏保护作用的重要机制。

本研究发现，CME发生后12 h，心肌组织PTNE蛋白表达明显升高，凋亡蛋白Caspase-3活化明显增高，心肌细胞调亡显著增加，心脏功能明显下降；然而，通过阿托伐他汀预处理，能够明显抑制PTNE蛋白表达及凋亡蛋白Caspase-3活化，激活p-Akt表达，降低心肌细胞凋亡，从而改善心脏功能。本研究为未来在PCI围术期使用阿托伐他汀降低心肌损伤，改善心功能及长期预后提供理论依据。