消毒剂胁迫对铜绿假单胞菌初期附着的可视化研究

2020-01-06杜邦单蓉蓉谷正

生物化工 2019年6期

杜邦，单蓉蓉，谷正

（合肥工业大学土木与水利工程学院，安徽合肥 230009）

余氯被广泛用于饮用水的处理，但研究表明当细菌形成生物膜后，余氯对生物膜的消除能力会受到影响。一般来说，饮用水通常采用氯、氯胺、臭氧、碘和紫外线消毒等方式进行处理，且相关测试显示铜绿假单胞菌等细菌对氯、氯胺、臭氧或碘不具有特异抗性。根据Fitzgerald等[1]的研究，在25 ℃时，氯含量为0.5 mg/L的游泳池需要1～3 h才能获得99.9%的铜绿假单胞菌的杀灭率；而天然水需要1 h能够杀死其中99.9%的铜绿假单胞菌。Xue等[2]的研究表明，氯的存在会使细胞膜和膜相关聚合物的化学官能团发生形变，阻止其可逆附着向不可逆附着的转变，从而阻碍了生物膜在新的表面上的扩散和定植；而分泌藻酸盐胞外聚合物较多的菌种，在余氯存在的情况下则具有更高的存活率。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验所使用的菌种Pseudomonas aeruginosa（运动型，Wild-Type PAO1）和PAO1 ΔfliC（敲除鞭毛相关基因fliC的铜绿假单胞菌，非运动型变异株）由中国农业大学资源与环境学院实验室提供。

试剂：LB培养基（奥博星，北京）；CDF缓冲溶液（Na2HPO40.54 g/L、KH2PO40.88 g/L、pH=6.98分析纯，国药集团，上海）；NaClO母液（分析纯，国药集团，上海）、SYTO 63（20 μmol/L Invitrogen,Thermo Fisher Scientific）。

仪器：LX-B50高温灭菌锅（华泰，合肥）；Eppendorf离心机（5810R，德国）；DNP-9162电热恒温培养箱（名宸，合肥）；Lambda 25/35/45分光光度计（PE，美国）；SK-O180-E水平摇床（大龙，北京）；SW-CJ-1FD超净工作台（一恒，上海）；LSM710激光共聚焦显微镜（Zeiss，德国）。

1.2 实验

以铜绿假单胞菌为例，确定细菌在不同浓度消毒剂胁迫下的初期附着情况。实验选择在无菌环境下的静止系统中进行，选择LB培养基作为营养来源，每个烧杯中营养条件一致。此外，设定一系列消毒剂的浓度梯度，消毒剂使用NaClO母液（上海国药，分析纯），在各反应器中添加一定量的NaClO母液，使各反应器环境中余氯浓度分别为0 mg/L（对照）、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L和3.0 mg/L。另外，实验过程均在超净工作台上进行，并封住杯口，避免杂菌污染。

实验开始前，在每个烧杯中平放三片PE载片（长×宽×高=3.0 cm×1.0 cm×0.2 cm），并加入相应量的NaClO母液，摇匀后，分别将1 mL的两种细菌菌悬液（已调整其OD600=0.5[3]）加入反应器中静置培养并开始计时，20 min后取样并进行相关指标的测定，每组实验均设有3个平行样，以保证实验准确性。

1.3 生物膜的可视化观察

载片取出后，使用生理盐水缓慢冲洗，为了研究不同浓度消毒剂环境下细菌的附着情况，需要对细菌进行标记与染色。染剂使用SYTO 63[4]。

对细胞的形态进行观察时，采用共聚焦激光显微镜LSM710与ZEN 2012 blue edition（Carl Zeiss Microscopy GmbH）软件进行组合分析。样品放置到激光共聚焦显微镜下，使用显微镜的40倍物镜进行观察，并用其中的Lambda-Z-stack对生物膜自上而下进行扫描，选取的视野区域尺寸为425 μm×425 μm，每个像素的尺寸是0.42 μm×0.42 μm×1 μm。使用ZEN软件对每个环境中附着在载片上的生物膜图像进行各个组分的拆分，得到各个组成成分在每一层上的图像。

运用图像中得到的信息，对生物膜上每一层被染色的面积进行统计，包括各个单独成分与组合成分，对染色面积与染色面积的比例（进行计算与统计，可以得到总细胞在视野范围内的体积，随后计算出单位面积上的附着细菌体积，体积的计算方法如公式1所示：

其中，α为体积计算时插入的参数，本文中选取参数为1/2[5]；dZ为图像每一层的厚度，为1 μm；a是Z-stack中选取的第一个界面；b是Z-stack中选取的最后一个界面，面积覆盖率是每一层上染色面积在视野面积（425 μm×425 μm）上所占的比例，可经计算得到。

生物膜的厚度是研究生物膜结构和外观的重要参数，一般方法是统计出每个x-y像素中荧光物质在z轴上的高度，进行统计可以得到每个像素中生物膜的厚度分布[6]。具体计算方法为：将面积覆盖率进行统计，作出面积分布图，x轴为面积分布率；y轴为Z-stack上的层数；0点对应的层数，为细菌总细胞数图层上面积覆盖率的峰值所在的层数，厚度的计算方法如公式2所示：

其中体积为公式1计算得出的该视野内物质的体积，面积分布律为该视野下某种物质（总细胞、多糖、蛋白质）的面积覆盖率最大值。相关研究要求，以总细胞数的最大值所在的层数作为零点，绘制出生物膜中不同层数总细胞数的染色面积分布图，蛋白质与多糖则以该零点所在层数为基础，各自绘出各自成分的染色面积分布图，用以比较该成分在生物膜中的所处的位置和分布。

2 结果与分析

2.1 附着细菌形成生物膜体积

激光共聚焦显微镜下生物膜形态如图1所示。

培养20 min后，对细菌数量进行统计，结果如图2所示。在初期附着阶段，运动型细菌的附着量显著高于非运动型细菌（t检验：P＜0.05），其平均附着量是非运动型细菌的1.22倍。

图1 不同消毒剂浓度下的生物膜形态（使用激光共聚焦显微镜观察）

消毒剂浓度对两种细菌的附着数量影响比较显著（单因素方差分析：P＜0.05）。随着初始消毒剂浓度的上升，两种细菌的附着量表现出了先增加后降低的现象，并且在1.0 mg/L的消毒剂环境中达到了峰值，运动型细菌为（13.13±0.29）μm3/μm2，而非运动型细菌为（10.16±0.58）μm3/μm2。

图2 不同消毒剂浓度下生物膜的体积

2.2 生物膜平均厚度

为进一步观察消毒剂的胁迫对生物膜形态形成的影响，对共聚焦激光显微镜所拍摄到图像中生物膜的相关信息进行了进一步的分析，平均厚度的结果如图3所示。对比两种细菌的平均附着厚度可以发现，具有鞭毛结构的运动型细菌在附着过程中具有优势，能够形成更厚的生物膜（t检验：P＜0.05），这是由于鞭毛结构有利于细菌寻找合适的吸附位点，并增加附着率。

此外，消毒剂浓度对细菌的平均附着厚度影响比较显著（单因素方差分析：P＜0.05）。随着消毒剂浓度的上升，运动型细菌生物膜厚度从（13.79±1.15）μm上升至（16.14±4.10）μm，当消毒剂浓度上升至3.0 mg/L时，厚度下降至（11.69±1.15）μm，对于非运动细菌也发现了类似的规律，这说明中度的消毒剂浓度能促进铜绿假单胞菌形成更加致密的生物膜。