膜分离技术纯化蔓三七叶多糖的研究

2020-01-06李华勇胡居吾

生物化工 2019年6期

李华勇，胡居吾

（1.江西省吉安市食品药品检验检测中心，江西吉安 343000；2.江西省科学院应用化学研究所，江西南昌 330096）

蔓三七，又名平卧菊三七，为多年生草本药食两用植物。蔓三七茎叶营养丰富，富含粗多糖和绿原酸等成分。民间利用其消炎止咳、通经活络、消肿止痛，可用于肺结核、支气管肺炎等疾病的治疗[1]。现代生物化学和医学研究证明，蔓三七具有消炎止咳、散淤消肿[2]、提高人体免疫力[3]、降血糖、降血压和抑制乙型肝炎等效果[4]。另一方面，蔓三七具有极好的营养价值，是一种药食兼可的独特植物，与木耳菜同属。食味柔滑、清香可口，可清炒、凉拌、氽汤，其叶也可生吃，或取鲜叶开水冲泡当茶饮，是一种高经济价值的“药食两用”植物。

多糖具有复杂的化学结构及丰富的生物活性，包括抗肿瘤[5]、抗炎[6]、抑制血管生成[7]、抗感染[8]、改善免疫功能[9]、调节血糖血脂[10]、保肝[11]等多种功效。

通过前期对蔓三七叶化学成分的研究，发现多糖类物质为其主要成分之一，截至目前，关于蔓三七多糖的研究一直处于空白，严重制约了蔓三七这一植物的综合利用。

传统多糖提纯方法（如盐析法等）操作耗时、耗能，超滤技术借助化学、物理或能量等外力差异，以膜孔径的大小进行液体中物质的分离和纯化[12]，不需要加热或添加化学试剂，具有条件温和、分离精度高、成本低、环保等特点，在植物多糖分离纯化方面有着良好的应用前景[13]。

本研究以蔓三七叶为原料，对蔓三七叶多糖的工业化生产过滤工艺进行研究，目的是获得蔓三七叶多糖生产相关超滤工艺参数，为促进蔓三七叶多糖产业发展提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蔓三七叶由江西华紫仁农业开发有限公司提供，经烘干、粉碎后过20目筛备用。无水葡萄糖，标准品，购自大连美仑生物技术有限公司；苯酚、硫酸均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

图1所示为膜分离设备图，浙江赛特膜技术有限公司生产；超滤膜，膜滤材质为复合膜，膜面积1m2；UV-1800紫外可见分光光度计，日本岛津仪器有限公司；METTLER-TOLEDOAL104型电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；Milli-Q型超纯水制备系统，美国Millipore公司；RE-52AA型旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；DZF-6090Z型真空干燥箱，上海跃进医疗器械有限公司。

图1 膜分离系统试验装置图

1.3 试验方法

1.3.1 膜分离纯化工艺流程

采用膜技术分离纯化蔓三七多糖的工艺流程如图2所示。

图2 膜分离纯化工艺流程

1.3.2 蔓三七叶粗多糖提取液工艺

取烘干、粉碎后的蔓三七叶，按料液比1∶15（g/mL）加入蒸馏水，于65℃恒温水浴下提取2.5h，离心、抽滤，滤渣部分继续用同样方法浸提，上清液合并浓缩后缓慢加入4倍体积的无水乙醇沉淀粗多糖，于4 ℃下低温静置24 h，再以4800 r/min离心10 min，收集下层粗多糖沉淀，最后用无水乙醇洗涤2次，沉淀物用65℃超纯水溶解，备用，用于超滤实验[14]。

1.3.3 蔓三七叶提取液纯化实验

采用超滤膜主要去除蔓三七叶提取液中分子量较小的无机小分子等。其中，膜孔径是影响膜分离中目标产物收率和含量大小的关键因素。通过研究蔓三七叶多糖分子量及组成，发现其分子量主要集中在1000KD以上。因此，选用截留分子量为1000KD的超滤膜进行试验，并对超滤膜截留液和透过液浓缩、干燥。操作温度和压力对膜分离过程和膜通量有显著的影响。因此，本试验以固收率、蔓三七叶多糖含量和膜通量为性能指标，考察流量、温度、时间和压力对膜分离纯化过程的影响。其中膜通量计算公式为：

式中，Q为膜通量，L/(min·m2)；V为超滤液体积，L；A为有效膜面积，m2；T为超滤时间，min。

1.3.4 超滤单因素试验

以料液膜通量作为试验指标，研究不同流量（15 mL/min、25 mL/min、35 mL/min、45 mL/min、55 mL/min）、不同温度（10℃、20℃、30℃、40℃、50℃）、不同时间（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min）、不同压力（50kPa、80kPa、110kPa、140kPa、170kPa）对超滤效果的影响。

1.3.5 超滤正交试验设计

在单因素试验的基础上，考虑到过滤成本和产品质量，固定料液流量为35mL/min，以操作温度、时间和压力为自变量，膜通量为试验指标，对蔓三七叶多糖提取液的超滤工艺参数进行优化，确定L9(34)的正交设计试验，选用因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.3.6 超滤验证

通过超滤工艺的单因素试验及正交试验分析结果确定蔓三七叶多糖生产中过滤工艺的最佳参数，依据最佳工艺参数进行蔓三七叶多糖提取液的超滤验证，平行3份，测定蔓三七叶多糖的膜通量。

1.3.7 蔓三七叶多糖含量测定[14]

1.3.7.1 标准曲线的绘制

根据不同浓度的葡萄糖标准溶液及其对应的吸光度，得到苯酚-硫酸法的回归方程为y=7.55x-0.078，R2=0.9994，表明总糖在0.021～0.166 mg/mL质量浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

1.3.7.2 粗多糖含量测定

精密称取样品10 mg，加超纯水定容至25 mL，即得0.4 mg/mL的供试品溶液。取适量样品溶液，平行3份，按1.3.7.1的操作方法测定样品中的总糖含量。

1.3.8 数据处理

实验数据以±s表示，采用Origin 8.0软件作图，SPSS13.0软件进行方差分析。

2 结果与分析

2.1 超滤工艺条件的确定

2.1.1 流量对超滤效果的影响

流量对超滤效果的影响见图3，蔓三七叶多糖提取液的膜通量随着进料流量的增大呈先上升后下降的趋势，在流量为35 mL/min时，蔓三七叶多糖提取液的膜通量最大，达0.88 L/(min·m2)。伴随进料流量的继续增大，蔓三七叶多糖提取液的膜通量有下降的趋势。因为在增加料液的湍流程度同时，也可降低溶质在膜层的浓度，减轻对凝胶层的影响。因此，考虑到超滤效率，选择料液流量为35 mL/min。

图3 流量对超滤效果的影响

2.1.2 温度对超滤效果的影响

温度对超滤效果的影响见图4，蔓三七叶多糖提取液的膜通量随温度升高呈不断上升的趋势，在提取液的温度为50℃时，蔓三七叶多糖提取液的膜通量最高，达为0.89 L/(min·m2)，比提取液的温度为30℃时高了14.6%，比20℃高了37.07%。其原因是，由于提取液温度的升高，料液粘度下降，流动性增强，膜通量也随之变大。但是，当提取液温度高于40℃，膜通量增加的速率逐渐变小，因为此时膜表面对大分子溶质的吸附随温度升高而增加，致使凝胶层逐渐加厚，膜孔堵塞，导致超滤效果降低。因此，考虑到滤膜的使用寿命和超滤效果，确定提取液温度为40℃。

图4 温度对超滤效果的影响

2.1.3 超滤时间对超滤效果的影响

超滤时间对超滤效果的影响见图5，蔓三七叶多糖提取液的膜通量随超滤时间延长而逐渐下降，超滤时间在5 min时，蔓三七叶多糖提取液的膜通量为0.90 L/(min·m2)；超滤时间在10 min时，蔓三七叶多糖提取液的膜通量为0.84 L/(min·m2)；超滤时间在15 min时，蔓三七叶多糖提取液的膜通量为0.71 L/(min·m2)；随着超滤时间的进一步延长，膜通量下降逐渐加快，这是因为发生了浓度差极化，许多大分子溶质会富集在膜表面，影响料液的超滤效率。因此，考虑到超滤效益，超滤时间定为10 min。

图5 时间对超滤效果的影响

2.1.4 超滤压力对超滤效果的影响

超滤压力对超滤效果的影响见图6，蔓三七叶多糖提取液的膜通量随超滤压力升高呈先上升后下降的趋势。当超滤压力为110 kPa时，蔓三七叶多糖提取液的膜通量最高，为0.86L/(min·m2)。在压力小于110kPa时，增大超滤压力，会增加膜分离过程中的推动力，使膜通量增大；当压力超过110 kPa时，膜通量略有下降，是因为大分子溶质在膜表面富集，凝胶层的厚度和密度相应增加，因而会影响超滤效率。因此，选择压力为110kPa。