基于可注射泊洛沙姆原位凝胶的响应面法制备研究

许宁侠，班滕，邢凯，徐明宇

（西安外事学院医学院，陕西西安 710077）

原位凝胶作为一种新型的药物载体，以其优良的环境响应性、生物相容性及药物负载特性而广泛应用于生物医学、临床医学、智能农业等多种领域[1-2]。泊洛沙姆是研究较为深入的一种制备材料，其主要机制是在临界胶束温度下，疏水性嵌段脱水，在水溶液中相互缠结而发生胶凝作用。但单纯的泊洛沙姆凝胶响应温度较宽、机械强度较小，不能满足实际需要。目前可采取将泊洛沙姆P407和P188合用的方法，制备高响应性凝胶[3]。原位水凝胶因具有环境响应，与作用部位具有较优良的形态契合性，如治疗老年性膝关节炎时，将原位温度敏感性凝胶作为治疗材料，在关节部位形成契合度较高的人工软骨，既能起到支撑作用，还能作为关节炎疾病治疗药物的载体。原位温敏性水凝胶的凝胶化时间是影响其临床应用的关键特性，而制备材料的浓度及组成是凝胶时间的主要因素。本实验利用泊洛沙姆P407和P188为基材，同时以卡波姆941为粘附剂，通过响应面设计方法，以凝胶时间为目标，对3种制备材料的浓度进行优化研究，以期获得较为敏感的凝胶化时间。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

泊洛沙姆P188和P407（巴斯夫股份公司，批号：WPAK592B）；卡波姆941（科瑞医药化工有限公司，批号：7514）；其余试剂均为分析纯。

SHZ-82恒温振荡器（常州国华仪器有限公司）；HJ-3恒温磁力搅拌器（金坛市新航仪器厂）。

1.2 原位凝胶的制备

称取泊洛沙姆P407（5 g，8 g，12 g，15 g，18 g，20 g，25 g）和P188(0.5 g，1.0 g，2.0 g，3.0 g，4.0 g，5.0 g，6.0 g)，分别溶于100 mL去离子水中，静置24 h至充分溶解，配制成不同浓度的溶液；称取卡波姆941(0.1 g，0.5 g，0.8 g，1.2 g，1.5 g，1.8 g，2.0 g)，溶于100 mL去离子水中于4 ℃搅拌至完全溶解，配制成不同浓度的溶液，完全溶解后，置冰箱中静置24 h备用。

1.3 凝胶化时间测定

采用倒置法检测凝胶时间。将泊洛沙姆P407、P188和卡波姆941溶液按不同的比例进行充分混合。将装有2 mL混合溶液的西林管置于37 ℃恒温水浴中，观察混合液的变化。当试管倒置后，溶液不再流动，则认为该溶液已凝胶化，所需的最短时间为此凝胶的凝胶化时间。

1.4 单因素实验

在进行响应面设计前，先分别考察P407、P188与卡波姆941的浓度改变对胶凝时间的影响。

1.5 响应面设计

以单因素实验结果为依据，根据Box-Benhnke的中心组合实验设计原理，采用响应面法[4]，以凝胶化时间为响应值，在三因素三水平上对原位温敏性凝胶的制备材料浓度进行优化。实验因子和水平见表1。

表1 响应面分析因子及水平

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

相转变后的凝胶形态与原位凝胶的应用部位有关。以泊洛沙姆P407和P188为基本材料，以卡波姆为粘合剂，三种溶液混合后在37 ℃条件下进行胶凝。

2.1.1 P407浓度对凝胶化时间的影响

P407浓度设置为5%、8%、12%、15%、18%、20%和25%，实验结果如图1a所示。随着P407浓度的增大，凝胶化所需时间减小。当P407浓度为20%，其凝胶时间为120 s左右，而浓度为25%时，其凝胶时间大约为100 s。虽然随着P407的浓度增加，凝胶的凝胶化时间缩短，但由于凝胶时间过短，影响实验操作过程，且实验误差会增加，因此响应面实验选择P407浓度范围为10%～20%。

2.1.2 P188浓度对凝胶时间的影响

设置P188浓度分别为0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%和6.0%，实验结果如图1b所示。凝胶化时间呈现双重变化趋势，即胶凝时间先逐渐减小后又缓慢增加，在浓度为3.5%时，凝胶时间最短，约为420 s。综合考虑，响应面实验选择P188浓度范围为3%～5%。

2.1.3 卡波姆941浓度对凝胶时间的影响

设置卡波姆941浓度为0.1%、0.5%、0.8%、1.2%、1.5%、1.8%和2.0%，实验结果如图2c所示。凝胶化时间随着浓度的增加而增加，在浓度为2.0%时，凝胶时间约为200s，而浓度为0.1%时，凝胶化时间约为150 s左右，因此后继实验选择卡波姆941浓度为0.0%～0.2%。

2.2 响应面实验结果

按Box-Benhnke设计各水平因素组合及不同浓度下的混合水凝胶的制备方案，以其在37 ℃温度下凝胶化时间为响应值,结果如表1所示。

表1 响应面实验设计及结果

对实验数据进行ANOVA分析，结果如表2所示。从表2分析可知，模型的R2为0.002 4，小于0.05，说明本实验方法是可行的。同时由p-value可知，P407浓度对混合胶的凝胶化时间影响显著（p＜0.000 1）。二次项对响应值的影响较小，说明因素之间的交互作用较小。图1为各个因素的交互作用响应面图的等高线，从响应面的最高点和等高线可以看出，3个因素在所选范围中均存在极值，其对应的最佳条件为：泊洛沙姆P407浓度20%，泊洛沙姆P188浓度4%，卡波姆941浓度0.15%，凝胶化响应时间为317 s。

图1 制备材料浓度变化对凝胶化时间的影响

2.3 方法可行性检验

为了检验方法的可行性，利用响应面分析法所得到的最佳条件进行制备原位凝胶，在37 ℃下测定其凝胶化时间，3次实验的平均值为300 s，与理论值相差0.56%，说明此响应分析方法对于泊洛沙姆P407、P188及卡波姆941的组成浓度在制备温度敏感性原位水凝胶的方法是可行的。

表2 响应面ANOVA分析结果

图2 各个因子的交互作用响应面图及等高线

3 结论

随着温度的升高，聚合物链中疏水链段间的疏水作用增强，而氢键作用减弱，聚合物链段缔合，形成凝胶。本文通过响应面法优化了泊洛沙姆P407、P188及卡波姆941的组成浓度，得出制备混合凝胶的最佳浓度，为后续膝关节炎的治疗研究提供了理论基础。