骨肉瘤的治疗进展

曹莉莉 朱岩 樊根涛 张军良 周幸 周光新

骨肉瘤是骨骼最常见的原发性恶性肿瘤，全世界发病率约为 3 / 100 万。原发性骨肉瘤占所有恶性肿瘤的0.2% 以下，主要发生在儿童和青少年，发病率的第二高峰是 50 岁以上者[1]。治疗骨肉瘤的主要手段是手术治疗，但是，单纯手术治疗骨肉瘤的患者的生存率是 15%～17%[2-3]。20 世纪 70 年代初，应用大剂量甲氨蝶呤、长春新碱和亚叶酸作为手术的辅助化疗把患者的存活率提高了3 倍。目前的疗法包括手术切除和联合化疗 ( 多柔比星和顺铂，以及联合或不联合甲氨蝶呤 )，可对约 70% 的患者具有疗效。对于骨肉瘤局部病灶患者，其对术前联合化疗的反应可以判断预后[4]。然而，转移性或复发性骨肉瘤患者的生存率在过去 30 年中几乎没有变化，总体 5 年存活率约为 20%[2,5]。

最近，关于免疫疗法的研究取得了极大的进步。临床试验已经使用输入细胞疗法治疗黑色素瘤，癌症疫苗 ( 如sipuleucel-T ) 治疗抗去势前列腺癌[6]，gp100 疫苗与白细胞介素-2 ( IL-2 ) 联合使用治疗晚期黑色素瘤，HPV 疫苗预防和治疗由 HPV 病毒引起的感染以及诱导的癌症[7]。这些疗法利用先天和适应性的免疫系统共同约束转化细胞生长的能力，试图增强肿瘤的免疫原性并刺激肿瘤杀伤活性，从而将疾病清除负担重新分配到患者本身[8-9]。

免疫疗法在骨肉瘤治疗中有着悠久的历史。100 多年前，外科医生 William Coley 使用热灭活的化脓链球菌和黏质沙雷氏菌 ( Coley’s toxin ) 混合物来治疗骨骼和软组织肉瘤患者，但其成功与否尚有争议[10-11]。最近，一项研究用卡介苗 ( BCG ) 和同种异体肿瘤细胞疫苗治疗可切除骨肉瘤患者的辅助免疫疗法发现，接受免疫治疗的患者中有18% ( 17 例有 3 例 ) 治愈或存活，而 12 例未接受免疫治疗的患者中，均有复发[12]。Coley’s toxin 和 BCG 都诱导了几种细胞因子 ( 包括 IL-6，IL-1β，TNF 和 IFN-γ ) 的全身表达，激活细胞毒性免疫细胞并灭活肿瘤细胞[13]。此外，发生术后感染的骨肉瘤患者的存活率与没有感染的人相比显著提高[14]。通常用于治疗骨肉瘤的化疗 ( 多柔比星，顺铂和烷化剂 ) 通过杀死免疫抑制调节性 T 细胞和骨髓来源的抑制细胞 ( MDSC ) 来激活免疫效应细胞而引起免疫抗肿瘤活性[15]。在骨肉瘤儿童患者中，化疗后淋巴细胞数量与预后恢复良好正相关[16]。因此，对于转移性和复发性骨肉瘤的治疗，免疫疗法可能具有巨大的潜力。本综述旨在对关于骨肉瘤的药物治疗进展做一简单综述。

一、免疫检查点抑制剂

许多免疫检查点是免疫系统的“硬性连接”，对于维持自身耐受、限制外周组织中的生理学免疫反应和减少附带损伤至关重要。但是这些免疫关卡同样可能被肿瘤细胞利用来逃避免疫系统的检查和打击。免疫检查点抑制剂具有临床应用前景，比如针对细胞毒性 T 淋巴细胞抗原 4( cytotoxic T lymphocyte associated antigen 4，CTLA-4 ) 的单克隆抗体，还有针对抗凋亡细胞死亡蛋白 1 ( programmed cell death protein 1，PD-1 ) 或 PD-1 配体 ( PD-L1 ) 的单克隆抗体，例如伊匹单抗[6,17]。这些抑制剂可增加内源性抗肿瘤的活性，并且可能对提高化疗、放疗和靶向治疗所诱导的肿瘤免疫原性具有良好的应用前景[18-19]。正如在骨肉瘤中观察到的那样，可以通过基因组高水平的不稳定性来加强靶向免疫检查点的途径以达到抑制肿瘤的效果。在多种肿瘤类型，包括黑素瘤和非小细胞肺癌[20]中可观察到高度突变率与 PD-1 和 PD-L1 靶向药物的总反应率之间显著关联，也就是说 PD-1 以及 PD-L1 可靶向骨肉瘤细胞以达到抑制肿瘤的效果。对用免疫检查点靶向剂治疗的患者进行超导免疫监测显示：基因组复杂的肿瘤产生新抗原，如果去除肿瘤耐药途径，则可驱动免疫应答。这些由肿瘤细胞产生的新抗原由肿瘤细胞基因突变产生[21]，即为肿瘤发展过程中积累的突变。CTLA-4 的多态性与骨肉瘤发展高风险相关[22-23]。与 CTLA-4 抗体结合的肿瘤裂解树突细胞，在转移性骨肉瘤小鼠模型中可降低免疫抑制调节性 T细胞数量，并提高细胞毒性 T 细胞的数量，从而提高骨肉瘤小鼠的存活率[24-26]。

在 15 例骨肉瘤患者的系列研究发现，PD-1 和 PDL1 表达存在于活检样本中 ( 分别为 47% 和 53% )，在切除物中不存在，而在转移灶中存在 ( 40% 和 47% )。PDL1 mRNA 在骨肉瘤组织中高表达，此项研究结果表明，活检或转移标本可能在评估 PD-1 和 PD-L1 的表达中最有价值[27]。肿瘤中 PD-1 与 PD-L1 的连接可抑制 CTL 增殖，抑制细胞因子产生，抑制细胞毒性，从而导致肿瘤发展[28]。PD-L1 被发现表达于转移性骨肉瘤样本中，而不是在原发骨肉瘤样本上发现[29]。这意味着随着骨肉瘤细胞在各脏器转移期间暴露于免疫系统，只有具有免疫抗性的肿瘤细胞能够存活。在转移性骨肉瘤小鼠模型中，通过单克隆抗体阻断抑制 PD-L1 的小鼠的中位生存时间与对照组相比，其存活率明显提高[30-31]。

在转移性骨肉瘤小鼠模型中，与抗 CTLA-4 阻断组合的抗 PD-L1 治疗在约 50% 的小鼠中可完全控制肿瘤扩散，产生肿瘤免疫，并可长期无病生存[32]。在转移性骨肉瘤小鼠模型的临床前研究中，联合单克隆抗 PD-1 抗体治疗与单独应用 T 细胞激动剂 CD137 蛋白抗体相比，联合方案增强了 T 细胞功能，并且显示出比单独用抗 PD-1治疗时更大的抗肿瘤作用[33]。最后，抗 CTLA-4 阻断与肿瘤裂解树突细胞的结合应用于转移性骨肉瘤小鼠模型中的细胞疫苗降低了调节性 T 淋巴细胞，增加了 CD8＋CTL 的数量并抑制了转移性疾病的生长，进一步支持了免疫治疗组合具有协同作用效果[34]。在对 413 例患者的汇总分析中发现[35]PD-L1 / PD-1 过表达与骨肉瘤转移密切相关，PD-L1 / PD-1 过表达的骨肉瘤患者显示出了更高的总死亡风险，也就是说 PD-L1 / PD-1 可能是骨肉瘤患者不良临床病理特征和预后不良的重要生物标志物。而且既往研究发现阻断 PD-1 / PD-L1 轴可通过增强 T 细胞免疫力来抵抗各种类型的癌症，在体内，抗 PD-1 抗体和顺铂的组合可显著抑制肿瘤的生长[36]，目前的数据表明 PD-1 / PD-L1 轴的阻断具有积极的预后价值。这些发现为使用 PD1 / PD-L1 阻断抗体作为治愈难治性骨肉瘤提供了理论依据。抗 PD-1 抗体现已在临床进行尝试性应用，是否对于复发性及转移性骨肉瘤具有明显的抗肿瘤作用，是否具有远期疗效，仍需继续进行远期观察分析。

二、米伐木肽

米伐木肽作为一种合成药物[37]，可激活先天免疫系统，比如其激活的单核细胞和巨噬细胞与 TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6 和 IL-8 的血清水平升高以及其它免疫细胞的衔接有关[38-39]。这些细胞因子在骨微环境的正常和病理过程中均具有重要作用，而且有实验表明 IL-6 可限制小鼠模型中骨肉瘤的生长以及发展速度[40]。当这些具有免疫效应的分子被包裹在类似于脂质体这一载体中时，可以被递送到肺部、肿瘤组织或其它转移灶中，进而激活免疫细胞及分子的作用，使其对骨肉瘤细胞产生杀伤作用[41]。米伐木肽首先在狗的骨肉瘤模型中显示抗肿瘤活性，其中位生存期为 222 天，而对照组为 77 天[42]。为了确定添加米伐木肽作为化疗补充药物是否能够改善预后，662 例局部骨肉瘤患者术前接受顺铂、甲氨蝶呤和多柔比星治疗，然后将患者随机分配接受异环磷酰胺和 ( 或 ) 米伐木肽进行化疗。结果显示添加米伐木肽后 6 年总体生存从 70%到 78% 显著改善 (P＝0.03 )[43]。出乎意料的是由于药物相互作用，这种效应在含有异环磷酰胺的方案中没有观察到。使用米伐木肽作为佐剂化疗的患者与单独接受化疗的患者相比，平均寿命额外增加 2.58 年，质量调整寿命额外增加 2.20 年[44-45]。化疗方案中加入米伐木肽虽然可改善转移性骨肉瘤患者的无事件和整体生存率的趋势，但是由于样本量较少差异仍然无统计学意义[44]，后续还需进一步观察疗效。

最近一项在原发性骨肉瘤小鼠模型中应用唑来膦酸与米伐木肽的实验表明，两者间无抵制效应，两种药物的组合在唑来膦酸诱导的骨保护作用和米伐木肽诱导的肺转移发展抑制方面没有显著差异。令人意外的是，在原发性骨肉瘤进展中部分观察到两者组合对肿瘤进展显著抑制，其中机制尚且不明[46]。

鉴于现如今米伐木肽与异环磷酰胺是否存在药物相互作用，其临床疗效是否有效以及治疗成本等因素，使得临床上对于米伐木肽的使用争议很大，而仅有欧盟允许米伐木肽在临床上使用。

三、细胞因子

1 型干扰素 ( IFN-α 和 IFN-β ) 已经在一系列恶性肿瘤中显示出具有抗肿瘤活性[47]。IFN-α 在包括骨肉瘤等几种癌症中具有抗增殖、抗分化、促肿瘤细胞凋亡和抗血管生成作用[48]，并且已被证明在骨肉瘤切除手术后作为惟一的辅助治疗可以维持比较高的肉瘤特异性存活率和无转移生存率[49]。在骨肉瘤的小鼠模型中，IFN-α 可阻止肿瘤生长[50-51]，同时 INF-α 的小型临床试验表明其似乎改善了存活率，并导致转移性骨肉瘤患者的部分肿瘤消退[52]。最近结束的 III 期临床试验 [ 欧美骨肉瘤研究 ( EURAMOS )；ClinicalTrials.gov IdentifierNCT00134030 ] 在对于术前化疗效果较好的 1400 例骨肉瘤患者的标准化疗药物中添加聚乙二醇化 IFN-α，但早期报道表明，可能是由于随访时间短，随机选择受试者不当，IFN-α2 长期治疗患者预期的耐药性差，IFN-α 对生存率影响不大[53]，所以其确切的结论很有限。但此次实验的意义是第一次跨洋多国参与组织骨肉瘤临床协同试验，这对于罕见病治疗快速发展具有重大意义。

更有很多研究表明高剂量的 IL-254、CD95、IL-12 等因子的表达与肿瘤的生长、诱导反应等方面具有相关性。在 CD95 上调的部分病例中，IL-12 抑制骨肉瘤生长[54-57]。而 CD95 的低表达与骨肉瘤预后差相关，许多肿瘤下调CD95 以逃避免疫监视[58-60]。

在肺部转移复发肿瘤的骨肉瘤患者中研究了吸入性粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子 ( GM-CSF )，其诱导人骨肉瘤细胞系 SAOS2 的分化和凋亡[61]，但研究发现该机制与改善骨肉瘤预后和免疫调节作用无关[62]，后续仍进一步探讨。

四、NK 细胞

免疫系统效应细胞具有攻击和消除癌细胞的潜力。转移性和原发性骨肉瘤细胞系均对体外和体内扩增活化的 NK 细胞具有敏感性[63]，并均异质性表达 NKG2D 受体配体[64-65]。在体外和原位骨肉瘤鼠模型中，NKG2D 受体和 NKG2D 配体结合，活化 NK 细胞并靶向骨肉瘤肿瘤起始细胞 ( TIC )，减少了它们形成骨肉瘤干细胞的能力。但是 NK 治疗仍有较大的临床局限性，比如需要注入大量细胞，分散治疗，缺乏细胞记忆，限于体内扩增[66-68]，尤其是 CD45RA＋初始 T 细胞在过继转移后对接受者特异性抗原的同种异体活性具有很高的激发潜力，导致临床移植物抗宿主病 ( GvHD )[69-70]。相比之下，CD45RA-CD45RO＋T 细胞对先前的病原体或疫苗发挥记忆反应并且可以介导移植物对肿瘤的作用而不诱导 GvHD[71-72]。最近一项优化性试验表明慢病毒转导显著增加 CD45RA- 细胞中 NKG2D的表达，NKG2D-CAR＋记忆 T 细胞显示出比未转导的细胞对抗骨肉瘤细胞系显著增加的肿瘤细胞毒性，同时保持健康细胞的完整性[73]。

五、肿瘤特异性抗原

骨肉瘤特异性抗原难以鉴别[74]，间质细胞缺乏特异性标志物，并且往往是非免疫原性[75]。几种在骨肉瘤中表达的抗原，其中大多数也存在于正常组织中[76-79]。HER2 在骨肉瘤中低水平表达，并且可被表达 HER2 特异性嵌合抗原受体的遗传修饰 T 细胞靶向[80]。唾液酸神经节苷脂 ( GD2 )在 50% 的骨肉瘤中表达[81]，其可能与肿瘤侵袭性增加相关[82]。在神经母细胞瘤中应用靶向 GD2 抗体的免疫治疗已经证实其安全可靠[83]，GD2 特异性抗体依赖细胞介导的细胞毒性可以杀死肿瘤细胞，其中机制涉及自然杀伤细胞[84]。目前 I 期临床试验正在研究对患有具有复发性或难治性骨肉瘤、神经母细胞瘤或黑素瘤的儿童和青少年使用人源化 GD2 特异性 mAb。该实验对已手术切除原发性肉瘤和孤立性转移灶的患者使用 GD2，GD3 和 GM2 三价疫苗，患者随机接受疫苗接种辅助免疫刺激物 OPT-821 或单独的免疫刺激剂[85]。早期数据显示，用疫苗治疗的患者血清反应持续，但无进展生存期并没有明显差异[86]。

在骨肉瘤中过表达的其它潜在抗原包括叶酸受体 α( FOLR1 )[87]和 CD14688。加载骨肉瘤碎片的 CD146 树突状细胞可消除小鼠和大鼠中植入和转移性的肿瘤细胞[89-90]。在对晚期骨肉瘤患者使用自体肿瘤裂解物 ( TL ) 脉冲的树突状细胞的一项研究中，37 例患者进行 DC 治疗，DC注射后 1 个月观察到血清 IFN-γ 和 IL-12 水平升高。在37 例中，35 例进行临床反应评估：28 例显示肿瘤进展，6 例疾病稳定，1 例在 DC 注射后 8 周显示局部反应。3 年整体无进展生存率分别为 42.3% 和 2.9%[91]。尽管 DC 治疗目前看来是安全的，并且可以在难治性骨肉瘤患者中产生免疫应答，但仅在少数患者中看到了改善。迄今为止，使用自体树突状细胞或骨肉瘤特异性抗原的疫苗接种策略仍然限于临床前或早期临床研究。

骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤。虽然骨肉瘤是一种对某些化疗药物具有敏感性的肿瘤，但癌细胞可能会产生耐药性，并有形成远处转移的倾向，主要是在肺部。新辅助化疗联合手术是目前临床治疗骨肉瘤的主要方案。新辅助化疗的应用，使得骨肉瘤患者生存率从单纯手术治疗的 15%～17% 提高至 70%[92]，但是，近 30 年来，骨肉瘤患者生存率确无进一步明显提高。同样，耐药性、转移性或复发性骨肉瘤患者的预后在过去 30 年中也几乎没有变化，总体 5 年生存率约为 20%[93]。大剂量甲氨蝶呤、阿霉素、铂类和异环磷酰胺是骨肉瘤化疗方案中常规药物，但是由于其缺乏特异性，取得疗效的同时也具有髓系细胞抑制性、肾毒性、肝毒性和心毒性等强烈的化疗毒副作用[94-98]。即便如此，上述化疗药物也对约 30% 的患者治疗效果不佳，吉西他滨、多西他赛等二线药物也难以达到较好的疗效。迄今为止，开发骨肉瘤治疗新药物的临床试验尚无明显突破，尤其是对于复发性和转移性骨肉瘤，因此寻找特异的分子靶点治疗是目前骨肉瘤诊治过程中亟待解决的任务。虽然如今抗 PD-1 抗体在临床进行应用，但其远期疗效仍需观察。

转录水平评估已经确定了细胞内的关键信号通路，这些信号通路被细胞因子 / 生长因子激活并维持癌细胞的增殖。这些数据导致了大规模的酪氨酸激酶抑制剂的开发，这些抑制剂在最初是有前途的多靶点药物，然而，随着临床实验的进展发现，大多数被寄予厚望的药物的药效都很低，远没有达到预期的疗效[99-104]，而有研究进一步强调了微环境参与癌细胞的增殖与迁移[100]。基于这些观察，提出几个可行的第二阶段的试验，比如使用去苏木酸或唑来膦酸靶向骨生态位[102]。事实上，大多数治疗方法都是针对肿瘤微环境的免疫反应调节因子，因此免疫小微环境也应被认为是针对肿瘤微环境的临床治疗方法，这些构成骨肉瘤微环境的细胞和分子的异质性，丰富了骨肉瘤治疗的潜在靶点，比如血管、T 细胞、巨噬细胞等[96-99]。

针对骨肉瘤靶向剂的抗性经常发生，并对临床实践造成重大的限制。用小分子药物对癌细胞进行长期挑战时，癌细胞所采用的各种分子机制可能会造成这种情况[105]。而有些实验则针对阿霉素耐药骨肉瘤中的线粒体，通过化学修饰 Dox，使其选择性地进入线粒体，但其疗效受到骨肉瘤细胞中 PGP ( P-糖蛋白 ) 的表达和心脏毒性的发展的限制，但这种针对线粒体治疗骨肉瘤的方法不免为我们提供了一个思路与方向[106]。此外，还有，硫醇化果胶－DOX 结合物[107]，新型生物还原 Chol-SS-mPEG 2000 聚合物[108]，包绕阿霉素的纳米凝胶[109]，骨－CD44 双靶向氧化还原敏感脂质体[110]等，这些化疗药物联合生物材料靶向肿瘤细胞的技术发展，可增加肿瘤组织的局部反应性，但是否可以显著的增加肿瘤坏死率以及针对远处转移灶具有同样疗效，仍需进一步相关生物实验。

免疫治疗作为一种新兴的全面抗肿瘤模式，其最终以更细微的方式利用免疫系统，提高人体耐受性和治疗效率。骨微环境为免疫系统的独特部分，其中细胞间串扰的免疫细胞因子与骨发育和骨动态平衡息息相关。为了彻底的研究其机制，需要其免疫功能的模型系统以及筛选人类样品的合适靶标来更好地了解免疫调节的治疗。目前免疫疗法正处于初级阶段，学界相信免疫疗法将会与手术，化疗联合，为晚期和转移性骨肉瘤患者带来更好的治疗效果。