海南岛黄瓜病毒病种类鉴定及其发生分布研究

车海彦　曹学仁　贺延恒　罗大全

摘  要：2018年11月—2019年3月，在海南省三亚、乐东、东方、儋州、澄迈、海口、万宁和五指山共8个市县，采集疑似病毒病的叶片样本302份，采用小RNA深度测序和RT-PCR检测发现，黄瓜样品中存在黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、甜瓜黄斑病毒（Melon yellow spot virus， MYSV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）和瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus， CCYV）共5种病毒，检出率分别为32.79%、31.46%、23.18%、9.61%和2.65%。病毒的复合侵染率为11.28%，有8种复合侵染类型，以其中2种病毒复合侵染为主。明确了海南岛黄瓜病毒病主要种类及发生分布情况。

关键词：海南岛;黄瓜病毒病;小RNA深度测序;病原鉴定;分布

中图分类号：S436.421.1      文献标识码：A

Distribution and Identification of Viruses from Cucumber in Hainan Island

CHE Haiyan， CAO Xueren， HE Yanheng， LUO Daquan*

Environment and Plant Protection Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences / Key Laboratory of Pests Comprehensive Governance for Tropical Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract： From November 2018 to March 2019， a total of 302 suspected virus-infected cucumber leaf samples were collected from 8 regions （Sanya， Ledong， Dongfang， Danzhou， Chengmai， Haikou， Wanning and Wuzhishan） in Hainan Island. Five viruses were detected including Cucumber mosaic virus （CMV）， Melon yellow spot virus （MYSV）， Cucumber green mottle mosaic virus （CGMMV）， Tobacco mosaic virus （TMV） ， and Cucurbit chlorotic yellows virus （CCYV） by small RNA deep sequencing and RT-PCR. The detection rate was 32.79%， 31.46%， 23.18%， 9.61% and 2.65%， respectively. Detection rate of co-infection was 11.28%. There were 8 kinds of co-infection types， and the co-infection of two viruses occurred most often. The distribution and species of viruses from cucumber in Hainan were clarified.

Keywords： Hainan Island; cucumber virus disease; small RNA deep sequencing; pathogen identification; distribution

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.019

黃瓜（Cucumis sativus L.）是我国各地普遍种植的重要蔬菜。病毒病是黄瓜生产的重要病害之一，严重影响黄瓜的产量和品质。据报道，侵染葫芦科作物的病毒种类有86种，其中暂定种有17种，类病毒有1种，共涉及到15个科、24个属[1]。侵染我国黄瓜的病毒主要有黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus， CMV）、烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus， TMV）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）、甜瓜黄斑病毒（Melon yellow spot virus， MYSV）、西瓜花叶病毒（Watermelon mosaic virus， WMV）、瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus， CCYV）、小西葫芦黄花叶病毒（Zucchini yellow mosaic virus， ZYMV）、番木瓜环斑病毒（Papaya ring spot virus， PRSV）等，而且随着气候变化和种植模式的改变，各地病毒病的毒源种类也不断发生变化[2-9]。

黄瓜是海南冬季重要的北运蔬菜之一，2017年海南岛黄瓜种植面积8144 hm2，年产20.46万t（海南统计年鉴2018），主要种植在三亚、万宁和澄迈等市县。2018—2019年对海南岛黄瓜病毒病的发生情况进行调查发现，大约90%黄瓜种植地在生长期间都受病毒不同程度的侵染，有的田块病毒病发生率高达100%。本文通过小RNA深度测序和RT-PCR技术对侵染海南黄瓜的病毒种类、复合侵染及发生分布情况进行研究，以期为海南黄瓜病毒病的综合防控提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  样品采集

2018年11月—2019年3月，在海南省三亚、乐东、东方、儋州、澄迈、海口、万宁和五指山共8个市县，采集疑似病毒病的叶片样本302份，置于-70 ℃冰箱保存备用。

1.2  感病黄瓜叶片样品sRNAs高通量测序及分析

将4个不同症状的病样混合，在液氮中研磨，采用TRIzol? Reagent （Invitrogen）提取样品总RNA，采用TruseqTM Small RNA sample prep Kit （Illumina）构建文库，采用6% Novex TBE PAGE gel， 1.0 mm （Invitrogen）回收文库，用TBS380 （Picogreen）微型荧光剂进行定量，在cBot上进行桥式PCR扩增，生成clusters，然后在Hiseq2000测序平台进行SE50测序。测序获得的原始数据进行质控分析后，获得clean small RNA序列，将质控获得的RNA-seq高质量测序数据进行拼接，将拼接结果在NCBI数据库中进行BLASTn和BLASTx比对，鉴定病毒的种类。sRNAs高通量测序委托上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.3  RT-PCR验证与田间采集样品的检测

1.3.1  RNA提取及cDNA合成  黄瓜叶片样品的总RNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的植物总RNA提取试剂盒。使用北京全式金生物技术有限公司的TransGen TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix将提取的叶片总RNA反转录成cDNA。

1.3.2  RT-PCR验证与检测  MYSV、CCYV、CMV、TMV和CGMMV的检测引物序列见表1，引物合成委托北京六合华大基因科技有限公司完成。PCR反应体系总体积为25 μL，其中含有2×Taq PCR Mastermix 12.5 μL、10 μmol/L的上游引物和下游引物各1 μL，cDNA 1 μL和灭菌ddH2O 9.5 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性3 min;95 ℃变性45 s，X ℃退火45 s（退火温度见表1），72 ℃延伸45 s，循环35次;72 ℃延伸10 min。

1.3.3  PCR产物克隆和测序  PCR扩增的特异性片段产物经纯化回收后与pMD18-T Simple载体连接，转化到Escherichia coli Competent Cell DH5α中，利用PCR反应筛选阳性克隆。委托北京六合华大基因科技有限公司测序。

1.3.4  序列分析  测序结果采用NCBI中BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行比对分析。

2  结果与分析

2.1  黄瓜病毒病田间症状表现

在海南，感染黄瓜病毒病的植株在田间常表现为中上部叶片皱缩、花叶、黄斑、叶脉扭曲、

叶肉褪绿、黄脉、叶边缘向上卷曲、黄化、叶脉褪绿、叶片变小和植株矮化等症状，同一感病植株上往往同时表现多种症状。用于小RNA深度测序的4个样品田间症状见图1。

2.2  感病黄瓜叶片sRNAs高通量测序和分析

黄瓜样品经sRNAs高通量测序后获得27 887 686条raw reads，質控后得到17 449 815条clean reads，将质控后获得的序列进行拼接组装，得到12 356个contigs，将拼接结果与NCBI病毒库进行比对，获得5种病毒的825个contigs，MYSV、CCYV、CMV、TMV和CGMMV分别为477、331、10、5和2个contigs，与NCBI中相应病毒的核苷酸序列相似性分别为89.04%～100%、93.88%～ 100%、95.51%～97.01%、99.60%～100%和100%。

2.3  sRNAs高通量测序结果的RT-PCR验证

为了验证sRNAs高通量测序鉴定病毒结果的可靠性，利用MYSV、CCYV、CMV、TMV和CGMMV特异性引物对样品进行了RT-PCR检测，扩增到了预期大小的片段，PCR产物测序后经Blast比对分析，与NCBI中发布的相应病毒的核苷酸序列相似性在98.83%～100%之间，说明所测样品中确实存在上述5种病毒，验证了sRNAs高通量测序结果的可靠性。将MYSV、CCYV、CMV、TMV和CGMMV共5种病毒的测序结果提交到GenBank，登录号依次为MN615290、MN615291、MN615292、MN615293和MN615294。

2.4  黄瓜叶片样本的病毒检测结果

采用RT-PCR对采集的302份疑似病毒感染的叶片样品分别进行MYSV、CCYV、CMV、TMV和CGMMV检测，结果表明（表2，图2），266 份样品中检测到病毒。5种病毒检出率从高到低依次为CMV 32.79%、MYSV 31.46%、CGMMV 23.18%、TMV 9.61%和CCYV 2.65%。CMV和CGMMV在采样的8个市县均有分布，TMV分布在三亚、乐东、东方、澄迈、海口和万宁共6个市县，MYSV分布在三亚、乐东、东方、澄迈和万宁共5个市县，CCYV在三亚、澄迈、海口、万宁和五指山共5个市县零星分布。三亚、澄迈和万宁样本中检测出的病毒种类最多，为5种;乐东、东方和海口样品中均检测到4种病毒;五指山样品中检测到3种病毒;儋州样品中检测到2种病毒。

在检测到病毒的266份样品中，236份样品为单一病毒侵染，30份样品为2～3种病毒复合侵染，复合侵染率为11.28%。有8种复合侵染类型，以2种病毒复合侵染为主。2种病毒的复合侵染类型为MYSV+CGMMV/CCYV/CMV，TMV+CMV/CG-M?MV和CCYV+CMV，3种病毒的复合侵染类型为CMV+TMV+CGMMV和MYSV+CMV+TMV（图3）。

3  讨论

本研究在采集的302份海南黄瓜叶片样品中共发现MYSV、CMV、CGMMV、TMV和CCYV 5种病毒，分属4个科，即番茄斑萎病毒科（Tospoviridae）、雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）、植物杆状病毒科（Virgaviridae）和长线形病毒科（Closteroviridae）。在田间，不同病毒的传播方式不同，MYSV主要通过棕榈蓟马（Thrips palmi）传播[12]，CMV主要通过蚜虫以非持久性方式传播[13]，CGMMV主要通过种子和机械操作传播[14]，TMV主要靠带有病毒的汁液传播[15]，CCYV主要通过烟粉虱[Bemisia tabaci （Gennadius）]传播[16]。研究发现不仅同一田块不同植株上的病毒种类可能存在差异，同一植株上也可能存在2～3种病毒的复合侵染，病毒种类和传播途径的多样化增加了海南黄瓜病毒病的防控难度，应加强种子种苗的病毒检测、病毒病害的田间监测以及蚜虫、棕榈蓟马、烟粉虱等传毒昆虫的防控。

2004年在日本甜瓜上首次发现CCYV[17]，目前中国台湾、湖南、海南、河南、新疆、山东等地均有发生[16，18-22]。本研究首次在海南黄瓜上发现CCYV的侵染，检出率为2.65%，仅在海南部分地区发生，但由于烟粉虱在海南周年发生，繁殖力强，极易导致CCYV在海南的快速蔓延，所以田间要加强CCYV的监测和烟粉虱的防控，掌握CCYV的田间发生规律，以减缓CCYV在海南的扩展蔓延速度。

海南黄瓜病毒种类为MYSV、CMV、CGMMV、TMV和CCYV，而北京顺义和昌平黄瓜病毒种类为CMV、WMV和ZYMV，山东黄瓜病毒种类为CMV、WMV、ZYMV和PRSV，深圳黄瓜病毒种类为CMV、WMV和PRSV，重庆黄瓜病毒种类为CMV、南瓜花叶病毒（Squash mosaic virus， SqMV）、芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus， TuMV）、WMV和ZYMV，上述地区黄瓜样品中均存在2种或2种以上病毒的复合侵染现象[2-6]。不同省份黄瓜病毒种类不完全相同，这可能与当地的气候条件、种植模式和栽培品种等有关。CMV、TMV在本研究和2013—2014年[23]样品中检出率分别为32.79%、9.61%和63.30%、21.33%;CGMMV在本研究样品中的总检出率为23.18%，在儋州、澄迈、万宁、五指山的检出率为36.36%～45.45%，三亞、乐东和东方零星发生，而2013—2014年样品中，CGMMV总检出率为22.67%，主要发生在三亚和乐东;MYSV在本研究和2017年[12]样品中，三亚、乐东、东方、万宁的检出率分别为67.39%、50.00%、15.38%、37.14%和50.00%、6.67%、3.33%、0.00%。与2013—2014年和2017年样品的检测结果相比，2018—2019年样品中CMV和TMV的检出率降低。CGMMV总检出率虽然变化不大，但分布范围发生了变化。MYSV的检出率明显升高，万宁样品首次检测到MYSV，MYSV的发生范围扩大，危害日益严重。同一地区，黄瓜病毒病的毒源种类和分布不断发生变化，因此，加强田间黄瓜病毒病的监测，对于黄瓜病毒病的综合防控具有重要意义。

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收稿日期  2019-11-08;修回日期  2019-12-30

基金项目  海南省重大科技计划项目（No. zdkj201813）;中国热带农业科学院基本科研业务费专项（No. 19CXTD-33）。

作者简介  车海彦（1976—），女，博士，副研究员，研究方向：植物病毒与植原体病害;*通信作者（Corresponding author）：罗大全（LUO Daquan），E-mail：luodaquan@163.com。