不同状态培养基下pH对香菇、滑菇及金针菇漆酶活性的影响

2020-01-04张维瑞刘盛荣周修赵阮俊峰陈纬纬崔晓伟

热带作物学报 2020年11期

张维瑞　刘盛荣　周修赵　阮俊峰　陈纬纬　崔晓伟

摘要：考察不同物理状态培养基条件下pH对香菇、滑菇、金针菇漆酶活性的影响，为香菇、滑菇、金针菇的栽培提供重要参考。固化培养基以及液体培养基以NaOH作为碱化剂，固体培养基以壳灰作为碱化剂，考察不同pH对3种食用菌漆酶活性的影响。结果表明：微碱化培养可提高3种不同食用菌的漆酶活力，并与培养基的物理状态有关。香菇在固化、液体、固体培养基中，pH分别为6.5、6.5以及6.0时漆酶活性最高，比对照提高5.3%～14.0%;金针菇适宜的pH分别为7.0、6.0和6.5，与对照相比提高35.9%～343.0%;滑菇适宜的pH均为6.0，与对照相比提高3.1%～94.9%。

关键词：pH;漆酶;香菇;滑菇;金针菇

中图分类号：S646 文献标识码：A

Effects of pH on Laccase Activity of Lentinula edodes， Pholiota nameko， and Flammulina velutipes Grown in Different State Media

ZHANG Weirui1，2， LIU Shengrong1，2， ZHOU Xiuzhao3， RUAN Junfeng1，2， CHEN Weiwei1， CUI Xiaowei1

1. School of Life Science， Ningde Normal University， Ningde， Fujian 352100， China; 2. Fujian Higher Education Research Center for Local Biological Resources， Ningde， Fujian 352100， China; 3. Edible Fungus Management Stations， Pingnan， Ningde， Fujian 352100， China

Abstract： Laccase is a key enzyme involved in the degradation and utilization of lignin and has a relationship with mushroom cultivation cycle and product quality. In this work， NaOH was used as the alkalization agent for both solidified media and liquid media， and shell ash was used for solid media， the effect of pH on the activity of laccase of Lentinula edodes， Pholiota nameko， and Flammulina velutipes grown in different state media was investigated for providing a basis for their cultivation. Results showed that the micro-alkalization of all tested culture media could improve the activity of laccase of the species， and its effect was related to media type. The optimal pH values of solidified， liquid， and solid media for L. edodes laccase activity was 6.5， 6.5 and 6.0， respectively， with a 5.3%?14.0% increase of laccase activity in relative to their controls， and for that for F. velutipes was 7.0， 6.0， and 6.5， and the increase in the activity under optimal pH values was 35.9%?343.0% compared with their controls. As to P. nameko， pH 6.0 was optimal for all three media for maximizing laccase activity， 3.1%?94.9% higher than those of their controls.

Keywords： pH value; laccase; Lentinula edodes; Pholiota nameko; Flammulina velutipes

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.11.012

漆酶是最早由日本科学家Yoshida[1]从漆树中分离得到一种可催化酚类反应的一种酶类，随后Bertrand[2]将其命名为漆酶（lactase）。漆酶是一种以铜离子为活性中心的多酚氧化酶，属蓝色多铜氧化酶家族[3]，能够催化酚类物质或者多酚类物质，生成对应的醌类化合物等[4]。漆酶广泛分布于多种植物、真菌、细菌以及少数昆虫中，在白腐真菌中的分布最为广泛，其研究一直受到人们的重视。

漆酶与木质素过氧化物酶、锰过氧化物酶等是参与木质素降解的重要酶类[5]。近年来，漆酶在造纸工业、饮料加工、环境保护等方面得到广泛研究及应用[6]。

食用菌栽培方面，漆酶在食用菌生长发育过程中起重要作用，参与培养料中木质素的降解，此外调控原基分化、影响子实体形态及发育[7]。孙淑静等[8]发现产漆酶能力强的菌株其菌丝生长速度较快;任鹏飞等[9]研究香菇不同生长阶段漆酶活性与农艺性状的相关性，发现漆酶活性与产量呈显著正相关。此外，漆酶分解木质素的同时还产生酚类或醌类化合物等有毒物质，是一种很好的杀菌剂，可抑制杂菌的生长，从而防止杂菌进一步污染[10]。严培兰等[11]发现漆酶活性高的黑木耳菌株，栽培产量高，其抗霉能力也高。因此，提高食用菌培养过程的漆酶活性，对预防食用菌杂菌污染、提高食用菌产量具有重要意义。

食用菌漆酶属一种诱导酶，受多种不同因素影响，与木质素及其衍生物相关的芳香族或酚类化合物、碳源或氮源种类浓度及其比例有关，此外金属离子及浓度、温度、pH对漆酶活性也有较大影响[12-13]，另外漆酶活性与不同菌株也有关。但迄今为止，研究主要集中于培养基、离子种类及浓度、材料孔径大小、温度等对漆酶活性的影响[5， 14-16]，但pH对漆酶活性的影响研究极少，尤其是固化培养基、液体培养基与固体培养基不同物理状态下的对比研究未见报道。本研究以香菇、滑菇、金针菇3种我国常规栽培菌类[17-19]为研究对象，对培养料进行微碱化处理，分析和比较3种食用菌在3种不同物理状态下的漆酶活性，为食用菌微碱化培养料处理提供依据，从而为降低栽培污染、提高栽培产量奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌种香菇L26、滑菇5188和金针菇F8801，均从福建省三明真菌研究所引进。

1.1.2 栽培料及培养基木屑、麸皮、石膏等购于福建省古田县食用菌辅料市场，壳灰购于福建省宁德市蕉城区壳灰经营部。

固化培养基：采用PDA培养基。

液体培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、酵母粉3 g、蛋白陈3 g、KH2PO4 1 g、MgSO4 0.5 g、 VB1 0.1 g，加水至1000 mL。

固体培养基：香菇、滑菇的固体培养基均为木屑（79%、78%、76.5%、75%）及壳灰（0、1%、2.5%、4.0%），以及20%麸皮和1%石膏，含水量为55%，灭菌后pH为5.5、6.0、6.5、7.0。金针菇固体培养基为棉籽壳（71%、70%、69%、67.5%）及壳灰（0、1%、2%、3.5%），23%麸皮、5%玉米粉和1%石膏，含水量为63%，灭菌后pH为5.5、6.0、6.5、7.0。

1.2 方法

1.2.1 培养基制作固化培养基为PDA培养基，其灭菌后在凝固前用0.1 mol/L NaOH调pH分别至6.0、6.5、7.0，CK（5.5，对照）为自然pH，制作平板，冷却、接种，25 ℃恒温避光培养。

液体培养基：培养基灭菌后用0.1 mol/L NaOH调pH分别至6.0、6.5、7.0，CK（5.5，对照）为自然pH;装入250 mL的三角瓶，装量100 mL，冷却后接种，置摇床150 r/min 25 ℃培养。

固体培养基：将阔叶树木屑、棉籽壳、麦皮粉碎，过20目筛，称料，将木屑、棉籽壳、麦皮、石膏干混搅拌均匀，壳灰溶于水后倒入料中，搅拌均匀;装入规格25 mm200 mm试管，每支装入40 g培养料，装料高度及松紧度尽可能一致，高压灭菌，121 ℃，灭菌150 min，灭菌后冷却，接种，25 ℃恒温避光培养。

以上实验每处理设4个重复。

1.2.2 固体培养基酸碱度测定灭菌前、灭菌后，以及不同培养时间取培养料2 g，加入5 mL的去离子水，充分混合，静置10 min用pH计测量酸碱度。

1.2.3 粗酶液提取固化培养基：培养10 d后，用打孔器在培养基菌丝生长外围取3 g培养基，加入30 mL去离子水，用SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机打碎（功率400 W、时间15 s），25 ℃浸提4 h，发酵液纱布过滤，离心机4000 r/min離心10 min，吸取上清液，即为粗酶液。

液体培养基：培养10 d，发酵液纱布过滤，其他操作同上。

固体培养基：培养15 d，距试管顶端菌丝1 cm处取菌丝及培养基混合体3 g，打碎，加入30 mL去离子水，25 ℃浸提4 h，纱布过滤，其他同上。

1.2.4 漆酶活性测定漆酶活性测定采用ABTS法，参照刘苹等[19]的方法。移取1 mL粗酶液置2支试管中，其中一支试管通过沸水浴灭活，作为对照。反应体系为1 mL粗酶液加入2 mL 0.25 mmol/L的ABTS缓冲液，反应3 min，分光光度计在410 nm波长处测OD值。定义每分钟使OD均值增加0.1所需的酶量为1个酶活力单位（U），用以下公式计算漆酶活力[20]。

式中：A为3 min吸光度;t为反应时间的变化量;V1为反应总体积（mL）;V2为测定酶活力时所取的酶液体积（mL）;为3.6104 mol/ （Lcm）;N为酶液稀释倍数。

1.2.5 数据分析方法数据采用DPS 7.05软件处理，统计方法为单因素方差分析，差异显著后进行LSD多重比较。

2 结果与分析

2.1 不同培养基状态下pH对香菇漆酶活性的影响

表1可知，3种不同物理状态培养基下，pH对香菇漆酶活性均有较大影响。除液体培养基pH 6.0与pH 7.0、固体培养基pH 6.5与pH 7.0差异不显著外，其余不同pH间差异均达显著水平。固化培养基和液体培养基pH 6.5时，香菇漆酶活性显著高于其他不同pH，其中固化培养基和液体培养基pH 6.5时漆酶活性分别比pH 5.5、pH 6.0和pH 7.0高14.0%、9.1%、10.4%和11.4%、6.5%、7.2%。固体培养基pH 6.0，菌丝产生的漆酶活性显著高于其他pH，pH 6.0时漆酶活力分别比pH 5.5、pH 6.5和pH 7.0高5.3%、6.6%和9.0%。由此可见，不同物理状态培养基下，适当提高pH均可提高香菇漆酶活性。固化培养基与液体培养基优化的pH为6.5，固化培养基为pH 6.0。

2.2 不同培养基状态下pH对滑菇漆酶活性的影响

表2可知，3种不同物理状态培养基下，pH对滑菇漆酶活性均有较大影响。固化培养基pH 5.5与pH 7.0差异不显著，其余pH间差异均显著。3种不同培养基pH为6.0时滑菇菌丝产生的漆酶活力显著高于其他不同pH，即pH 6.0能显著提高滑菇的漆酶活性。固化培养基、液体培养基和固体培养基pH 6.0时漆酶活力分别比pH 5.5、pH 6.5和pH 7.0提高18.6%、7.8%、25.9%，94.9%、251.2%、433.4%和3.1%、5.8%、9.8%。3种不同培养基的适当提高pH均可提高滑菇漆酶活力，最佳酸碱度均为pH 6.0。

2.3 不同培养基状态下pH对金针菇漆酶活性的影响

表3可知，3种不同物理状态培养基下，pH对金针菇漆酶活性均有较大影响。液体培养基pH 5.5与pH 7.0、固体培养基pH 6.0与pH 7.0差异不显著，与其他所有pH间差异显著。固化培养基pH 7.0，金针菇菌丝产生的漆酶活力显著高于其它配方，分别比pH 5.5、pH 6.0和pH 6.5高75.1%、42.2%和21%;液体培养基pH 6.0时漆酶活力显著高于其他配方，分别比pH 5.5、pH 6.5和pH 7.0高3.4倍、1.6倍和3.1倍。固体培养基pH 6.5时，金针菇菌丝产生的漆酶活性显著高于其它配方，分别比pH 5.5、pH 6.0和pH 7.0高35.9%、12.2%和9.9%。由此可见，不同状态的培养基适当提高pH值均可提高金针菇漆酶活性。最佳产漆酶活力酸碱度各不同，固化培养基为pH 7.0，液体培养基为pH 6.0，固化培养基为pH 6.5。

3 讨论

不同pH对3种食用菌漆酶活性均有一定影响，适当提高pH可提高3种不同食用菌漆酶活性，影响程度与培养基物理状态也有关，表明培养料酸碱度是影响漆酶活性的重要环境因素。香菇在固化培养基和液体培养基中培养时pH 6.5时具有最高漆酶活性，固体培养基pH为6.0;滑菇采用不同状态培养基培养时，pH 6.0漆酶活性均为最高;金针菇最高漆酶活性在固化培养基为pH 7.0，液体培养基为pH 6.0，固体培养基为pH 6.5。

3种供试菌类在3种不同物理状态培养基下培养，其漆酶活性最优pH均不完全相同，但均在该种菌适宜的菌丝生长范围[21]。本研究液体培养基培养香菇最高漆酶活力所要求的pH与鹿桂花等[22]的液体培养香菇相一致;滑菇适当提高pH至6.0漆酶活性最高，这与张福元等[23]液体培养滑菇时最高生物量pH相一致;刘苹等[20]研究液体培养金针菇最高漆酶活力的pH为6.0，与本研究相吻合。

固体培养基时金针菇最高漆酶活力的pH与课题组金针菇工厂化栽培菌丝生长最快、产量最高的pH一致[24]，显示漆酶与食用菌菌丝生物量、菌丝生长速度以及子实体产量等密切相关。此外，由于木霉、链孢霉等食用菌的常见杂菌多适宜在较低酸碱度的培养基中生长，提高培养基酸碱度有利于杂菌的控制，但其对香菇、滑菇产量及质量的影响有待后续研究。须指出的是本研究只测试了菌丝个别生长阶段的漆酶活性，但漆酶在菌丝不同生长时期的活力是变化的，因此，后续实验中将进一步对菌丝不同生长时期的漆酶进行持续测定，以期为3种食用菌的培养料微碱化栽培提供参考。

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