环介导恒温扩增技术检测人冠状病毒的研究进展

青岛海关 （山东，青岛，266071）

冠状病毒（Coronavirus，CoV）是一类严重危害人类和畜禽健康的致病微生物，普遍存在于自然界中，自然宿主包括人、牛、猪、犬、禽、猫、蝙蝠、鼠等，广泛宿主特点和自身基因组结构使其演变过程中较易发生基因变化，呈现基因遗传多样性，新冠状病毒和亚型不断出现[1]。目前已知能感染人的冠状病毒共7种，分别为20世纪60年代发现的人冠状病毒 229E（HCoV-229E）[2]和 OC43（HCoV-OC43）[3]，2003年新出现的SARS冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome virus，SARS-CoV）[4]，2004 年发现的人冠状病毒 NL63 （HCoV-NL63）[5]，2005 年新发现的人冠状病毒香港 I（HCoV-HKU1）[6]，2012 年在中东地区出现的中东呼吸综合征冠状病毒（MERSCoV）[7]，2020 在武汉出现的新型冠状病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARSCoV-2）[8]。

核酸扩增技术是生命科学领域非常有效的技术，传统的检测方法如常规培养、血清学和免疫学方法等均存在局限性[9]。自上世纪90年代起，科研人员发展了十多种核酸恒温扩增技术，包括环介导恒温扩增技术 （loop mediated isothermal amplification，LAMP）[10]， 核酸序列依赖的扩增技术（Nucleic Acid Sequence Based Amplification，NASBA）[11]， 重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）[12]，重组酶介导扩增技术（recombinase aid amplification，RAA）[13]，滚环扩增技术（rolling circle amplification，RCA）[14]，链替代扩增（strand displace ment amplification，SDA）[15]，依赖解旋酶的恒温基因扩增技术 （helicase-dependent isothermal DNA amplification，HDA）[16]等。 本文着重介绍LAMP 技术在检测人冠状病毒的研究进展。

1 LAMP基本原理

LAMP是Notomi等于2000年提出来的一种核酸恒温扩增技术，它针对目的基因的6个区域设计4条特异性引物（内引物和外引物各2条），利用拥有链置换特性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下快速、高效、高特异的扩增目的序列，包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段等几个阶段。LAMP基本原理是DNA变性后在Bst DNA聚合酶作用下内外引物不断延伸，内引物延伸产物被外引物延伸产物置换出来，形成哑铃状DNA，再进入循环扩增阶段，不断延伸和扩增，最终形成茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显示不同大小区带的阶梯式图谱[9]。

2 LAMP技术特点

LAMP技术是一种新颖的核酸扩增技术，与传统核酸扩增技术比较，LAMP的主要特点是[17]：

灵敏度和特异性高：检出限仅为几个拷贝，与PCR相比高出几个数量级。利用外引物和内引物与目的片段6个特异性部位准确结合发生扩增反应，只有当2对引物与目的片段6个区域都匹配时才进行扩增。LAMP扩增结果只有是和否，相比于PCR具有更高特异性。

检测速度快、扩增效率高：LAMP是恒温扩增反应，无需预先热变性双链DNA，避过PCR退火、复性过程，避免温度循环而造成的时间损失，能够满足临床样本的快速检测需要。60-90分钟内完成基本反应并检测扩增产物，加入环引物后，可在30-45分钟内完成反应。通过链取代并形成不同环结构而大量扩增，促使目的基因在反应时间内连续进行指数扩增，拷贝数可达109-1010，浓度可达0.5mg/mL，高于PCR 103-104倍。

设备简单、操作简便：由LAMP反应只需要如水浴锅、金属浴等恒温器即可完成此实验，不需要购置昂贵的PCR仪，易于推广应用。除Bst DNA聚合酶必须在模板预变性以后再加样外，其他与PCR基本相同；由于反应温度恒定，反应后通过判断颜色变化而无需电泳。

产物易检测：根据LAMP反应特性，判断产物结果的方法有琼脂糖凝胶电泳检测法、浊度检测法和荧光比色检测法等。LAMP反应过程中产生多种片段的扩增产物，其在电泳中会形成特异性的梯状条带，此为电泳检测法。由于LAMP反应过程中产生大量的焦磷酸镁沉淀，可根据是否形成白色沉淀来定性判断结果，此为浊度检测法。通过SYBR GreenⅠ、钙黄绿素（Calcein）荧光染料的颜色变化来定性判断靶序列扩增与否，阳性为绿色，阴性为橙色，此为荧光比色检测法。另外，通过实时浊度计检测反应过程中焦磷酸镁沉淀产生的浊度实现定量检测。

3 LAMP在检测人冠状病毒中的应用

目前，LAMP已广泛应用于食品分析、生物安全、疾病诊断和环境监测等领域，已经实现细菌、病毒和寄生虫等病原微生物的快速检测，尤其在病毒方面的快速检测发展迅速，可对多种病毒进行检测和鉴定，成为前景广阔的快速诊断手段。而国内外也有研究将LAMP应用于人冠状病毒的检测，多采用浊度检测法和荧光比色检测法来判定结果。

3.1 LAMP在检测MERS-CoV中的应用

LAMP在MERS-CoV检测中多采用N基因作为靶基因，其次为开放阅读框架 （Open reading framework，ORF）和包膜蛋白（envelope protein，E）基因，且方法特异性较高，未发现与其他呼吸道病原体发生相关的交叉反应。

关丽等建立了基于浊度仪和羟基萘酚蓝（Hydroxy naphthol blue，HNB）颜色变化的简单、快速和灵敏的环介导逆转录等温扩增技术（RT-LAMP）方法应用于MERS-CoV检测，对于每反应管拷贝数RNA，出峰时间与每反应管核衣壳蛋白 （nucleocapsid protein sequence，N）基因103-106的RNA拷贝对数值有稳定线性关系，基于浊度仪和颜色判定的RTLAMP检测限分别为500和1000拷贝[18]。赵娜等建立了基于N基因检测MERS-CoV的RT-LAMP方法可检测到为 1-100 拷贝/反应（25 μL），并筛选出高特异性引物，安全、便捷、快速且高通量。体系中只需加入模板并结合配套仪器，耗时不超过45分钟，对口岸等人员流动性大的地区疑似患者进行快速筛查，展现出良好的应用前景[19]。Shirato等利用基于N基因的RT-LAMP方法可检测到3.4个拷贝的MERS-CoV RNA，且与其他呼吸道病毒无交叉反应，该法的灵敏度与实时RT-PCR法相似[20]。Li等利用基于RT-LAMP检测MERS-CoV，使用识别N基因的6个引物进行核酸扩增。产物通过LA-320c环放大器浊度计（实时RT-LAMP）检测或通过预先添加羟基萘酚蓝（可视RT-LAMP）目视检查颜色变化。通过对几种人冠状病毒和常见呼吸道病毒的检测验证RT-LAMP的特异性。MERS-CoV实时RTLAMP在 10 （3）-10 （6） 拷贝的线性相关 （R2）为0.995。实时RT-LAMP、可视RT-LAMP和定量实时PCR 检测限分别为 500、1000 和 100 拷贝/反应[21]。Lee等建立了基于one-pot RT-LAMP的高效、快速、高特异性检测MERS-CoV的方法。利用N基因设计了一套 LAMP 引物 （F3、B3、FIP、BIP、Loop-F 和Loop-B），优化了 RT-LAMP酶条件：100 U M-MLV RTase和4 U Bst聚合酶，该反应能够在60分钟内检测到4个MERS-CoV感染性病毒基因组拷贝。EvaGreen染料在one-pot RT-LAMP反应中具有更好的信号读出特性，并且比SYBR green I更适合DNA聚合酶。利用可现场部署的微腔装置进一步评估了等温扩增的特异性N基因，与其他急性呼吸道疾病病毒包括H1N1和H3N2、乙型流感、HCoV-229E，以及人偏肺病毒没有交叉反应[22]。 Huang 等建立了一种结合逆转录环介导的等温化技术和垂直流动显示条（RT-LAMP-VF）检测MERS-CoV N基因的可视化技术，该法可检测20拷贝/μL的合成RNA转录物和10拷贝/μL的MERS-CoV RNA，并且与 SARS 相关冠状病毒、HKU4、HKU1、OC43 和229E等多种冠状病毒无交叉反应。与实时RT-PCR方法相比，该法操作简便，不需要昂贵的设备，可在35分钟内快速完成检测[23]。Shirato等基于专门用于监测引物衍生信号的淬火探针建立quenching Probe RT-LAMP（QProbe-RT-LAMP）方法检测MERSCoV。两个引物集（靶向N基因和ORF1a序列）均能检测到与现有基因诊断方法相同水平的MERSCoV RNA，与其他呼吸道病毒没有交叉反应。这些引物集可高效扩增来自不同MERS-CoV株（包括骆驼MERS-CoV株）的靶序列。此外，该法检测效果与沙特阿拉伯患者临床标本的实时RT-PCR检测效果相当[24]。Bhadra等建立了非对称五引物 RTLAMP方法检测MERS-CoV，扩增位于ORF1a和ORF1b基因以及E基因上游的基因位点。另外，为LAMP扩增产物实时序列特异的证实，添加了一步链置换探针（OSD）。通过在每个试验中加入一个单环引物，不对称扩增加速了OSD-RT-LAMP结果。30-50分钟内，在感染细胞培养上清液中可以检测到 0.02-0.2 PFU（5-50 PFU/mL）的 MERS-CoV，并且与普通人呼吸道病原体没有交叉反应[25]。

3.2 LAMP在检测SARS-CoV和其他人冠状病毒中的应用

吕恒等建立了基于SARS-CoV ORF1b保守区域的LAMP可视化法，在此基础上应用颜色指示剂Calcein判定反应结果，使LAMP的结果判断更简单直观，为疫情现场调查、反生物恐怖检测等提供快速可视化的检测方法。本方法最低检出限约为10拷贝/反应管，高于普通PCR；检测特异性高，仅SARS-CoV反应管Calcein颜色由褐色变为黄绿色，而甲型H1N1病毒、高致病性H5亚型禽流感病毒、普通流感病毒均不发生变色反应；体系的扩增效率高于普通PCR，35分钟内出结果[26]。Hong等建立了一种基于ORF1b复制酶基因快速检测SARS-CoV的单管快速实时定量RT-LAMP方法，与常规RTPCR比较，灵敏度提高100倍，检测限为0.01 PFU，检测临床标本中病毒RNA的敏感性和特异性分别为100%和87%。通过限制性内切酶切分析和扩增产物的核苷酸序列分析进一步验证了RT-LAMP分析的特异性。根据RT-LAMP标准曲线和阳性时间测定，大多数临床标本的病毒浓度为0.1 PFU。分析过程非常简单，在单管中进行扩增，不到1小时（最早11分钟）内即可得结果[27]。Poon等将实时LAMP方法检测SARS-CoV与定量PCR方法进行比较，两种方法都没有产生假阳性结果。对发病前3天内分离的样本，定量PCR检测率 （14/15为阳性）高于LAMP检测（9/15为阳性）；对3天以上疾病患者样本的检测率相似 （PCR检测44例中32例阳性，LAMP检测44例中33例阳性）[28]。耿合员等利用基于颜色判定的RT-LAMP技术检测HCoV-NL63 N基因，在扩增前加入Calcein作为反应指示剂，并结合浊度仪进行实时监测，以最终反应颜色变化作为结果判断标准，该法在40分钟可达到对HCoVNL63的检测，并且与加入同种属其他人冠状病毒、诺如病毒、流感病毒RNA模板溶液颜色均不产生改变，检测特异性较高。最低检测下限为1600拷贝/反应，可实现对HCoV-NL63现场快速检测，具有在国境口岸以及基层医疗机构和疫区现场推广应用的潜力[29]。Pyrc等利用基于N基因的LAMP方法检测HCoV-NL63 RNA，发现该方法的特异性较好，与其他呼吸道病毒无交叉反应。在细胞培养上清和临床样本中的检测限为1个拷贝/反应[30]。耿合员等利用基于颜色判定的RT-LAMP技术检测HCoVOC43 N基因，在扩增前加入Calcein作为反应指示剂，以最终反应颜色变化作为结果判断标准。选定的1组特异性引物使HCoV-OC43 RNA产生特异性反应并出现颜色改变，而与甲型、乙型流感病毒和其他HCoV均不能，具有较高的特异性。与常规荧光定量RT-PCR 法相比，灵敏度达 5.6 拷贝/反应[31]。刘胜牙等建立了检测HCoV-HKU1的LAMP，设计5套LAMP扩增引物，以合成的HCoV-HKU1质粒为模板，通过实时浊度法进行最佳引物组的筛选，发现HCoV-HKU1 LAMP对其他病原微生物和人类基因组无反应信号。该方法可以检测到1拷贝/μL的HCoV-HKU1质粒。HCoV-HKU1 LAMP扩增方法特异性好、灵敏度高[32]。

4 展望

LAMP技术是一种近些年发展起来的核酸恒温扩增技术，与传统核酸扩增技术比较，具有灵敏度和特异性高、检测速度快、扩增效率高、设备简单、操作简便、产物易检测等优点，比较适用于基层医疗和检验检疫机构。已有多种LAMP试剂盒实现商业化和国产化，检测成本进一步降低，促进了LAMP技术的发展。但也有一些不足，如需购置荧光定量PCR仪或浊度仪、扩增对引物要求高、筛引物工作量繁重、开盖容易造成气溶胶污染等，因而需要采取必要措施解决不足之处。截止到目前为止，在检测人冠状病毒核酸方面，已有检测HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HCoV-OC43、SARS-CoV 和 MERSCoV核酸方面的研究，但未有研究显示LAMP技术应用HCoV-229E和新型冠状病毒核酸的检测。将来在现今研究的基础上，补足LAMP在检测人冠状病毒方面的缺失，同时联合其他技术方法进一步对LAMP扩增过程进行优化，建立起更加有效的检测方法并逐步推广到临床。