脱细胞外基质支架材料在骨再生中的应用及研究进展

张艳珉，姜治伟，杨国利，王慧明

肿瘤、创伤、发育畸形、感染等原因造成骨缺损的快速而功能性修复一直是临床医生们的追求。近年来，骨缺损修复材料不断更新与发展，自体骨移植一直被视为“金标准”，开辟第二术区和取骨量不足的问题使得临床的普及应用受限制,异体骨因免疫排斥问题临床普及应用也受限制；随着生物材料学的不断进步，人工合成材料和生物活性材料的出现扩大了骨缺损修复的应用范围，取得了良好的修复效果，代表性的材料有：生物活性玻璃材料、聚合支架材料、钙磷为基础的生物活性陶瓷支架材料、复合支架材料、金属材料，但是这些材料也存在着一些问题，如生物活性降低、生物相容性差、支架降解等、并不能提供骨再生过程中稳定的微环境[1]。理想的骨缺损修复材料应满足以下关键因素：种子细胞的募集、缓释生长因子及提供一个稳定的模拟微环境的生物活性支架。随着组织工程的不断发展，脱细胞外基质(dECM)材料因促进种子细胞的粘附、增殖、调控成骨分化、维持干性、挽救衰老干细胞活性、血管生成作用、富含丰富的生长因子等优点逐渐受到学者们研究和关注，脱细胞外基质材料按照其来源可分为细胞来源的脱细胞外基质材料和组织、器官来源的脱细胞外基质材料，细胞来源的脱细胞外基质因细胞来源广泛，大量扩增，种类丰富而备受学者们关注，本文仅围绕细胞来源的脱细胞外基质材料在骨再生中应用及研究进展做一综述。

1 dECM的成分及制备原理

dECM材料不仅具有组织特异性，而且成分结构处于动态变化之中,是由多种蛋白成分、生长因子、对细胞生理功能发挥重要作用的小分子物质组成的错综复杂的结构[2]。蛋白成分主要由胶原、弹性蛋白、硫酸软骨素等结构蛋白以及纤连蛋白、层粘连蛋白、玻连蛋白和韧粘素等粘结蛋白组成,此外，还有丰富的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblastic growth factor , bFGF)、血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor, HGF)等生长因子[3-5]。

脱细胞处理最关键的是去除具有免疫源性细胞成分和细胞核成分的同时保持dECM结构的完整性。目前，常用制备dECM的方法主要有三种：生物化学处理(Triton X-100、SDS等有机溶剂去除细胞成分,DNA酶和RNA酶等生物酶类去除细胞核成分)、物理方法处理(反复冻融、机械震荡)、化学处理(SDS等有机溶剂去除细胞和细胞核[6-8])。应根据特定细胞类型、细胞密度、细胞外基质厚度和细胞厚度选择有效的脱细胞方法[9]。目前有研究针对组织制定了脱细胞的参考标准：HE染色，DAPI染色观察不到细胞核；每毫克干燥组织DNA定量少于50 ng；DNA 片段大小在200 bp以下[10]。但是针对细胞来源的dECM脱细胞尚无一致的标准。目前的大多数研究思路是脱细胞处理后通过细胞骨架染色、DAPI染色、DNA含量这三个参数评估脱细胞是否相对彻底,通过I型胶原定性定量评估dECM的结构是否相对完整[11-12]。

2 dECM的生物学性能及作用

2.1 dECM维持种子细胞干性，调控成骨分化

有研究表明，人类骨髓间充质干细胞来源的细胞外基质能维持大鼠脂肪干细胞的干性，包括自我更新多向分化潜能及细胞增殖能力,促进脂肪干细胞的成骨分化[13-14]。细胞膜片经脱细胞处理后形成dECM片层定植在钛片上，该dECM片层与钛片复合体能够调节骨髓间充质干细胞(BMSC)的形态、增殖和成骨分化[15]。此外，年轻间充质干细胞来源的dECM能够挽救衰老干细胞的复制和成骨能力[16]。

2.2 dECM促进种子细胞粘附、增殖

与I型胶原相比，接种在人类间充质干细胞来源的生物活性dECM表面的种子细胞具有明显的增殖、粘附、迁移和多向分化潜能[17]。更为重要的是，dECM中含有丰富的骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor, IGF)、成纤维细胞生长因子-2(fibroblast growth factor-2, FGF-2)、血管内皮生长因子(vascular epithelial growth factor,VEGF)等内源性生长因子，尤其是BMP-2、IGF对成骨分化是极为有利的[18]。

2.3 dECM提供种子细胞营养与活力的微环境

dECM由于大量的Ⅰ型胶原成分在细胞冻存中保持种子细胞的生命活力发挥了重要生物功能[19]。值得关注的是，内源性dECM不仅能显著促进3D细胞聚合体的形成，而且还能维持缺氧环境下3D细胞聚合体中细胞的活力、增殖与多向分化潜能[20]。骨缺损修复中血管化生成为骨再生提供了血供来源、运输营养、排泄代谢物等微环境。血管化功能骨也因此倍受学者关注，相关研究发现细胞来源的dECM不仅对影响人脐带静脉内皮细胞的血管形态至关重要，而且还提供了一个促进人脐带静脉内皮细胞血管生成的微环境[21]。基于此，dECM作为一种具有生物活性的天然材料在骨再生中得到了广泛应用与研究。

3 dECM材料在骨再生中的应用及优缺点

3.1 dECM蛋白成分与合成支架材料涂层

dECM可以制备成均质混匀的dECM溶液，然后涂层在生物支架材料表面例如PLGA/PLA网状支架、BG/PLG复合支架，并进行干燥灭菌处理，体内体外实验均证明这种dECM蛋白分子涂层复合支架能促进细胞粘附和成骨效应[22-23]。尽管dECM蛋白成分与支架材料形成复合涂层具备良好的成骨效应，但是dECM的三维微观结构会遭到破坏，而且并不能模拟天然细胞外基质(ECM)复杂的活性成分，仅仅是局限于某种生物活性成分发挥的成骨效应，成骨效应的潜能有待进一步发掘。

3.2 将粘附在生物材料表面的细胞进行脱细胞处理

有研究在3D打印PCL/PLGA支架表面接细胞，利用旋转生物反应器进行3D细胞培养形成有效的营养供应以促进细胞外基质的形成，最后脱细胞处理接种细胞的3D打印支架，形成一个ECM涂层的3D打印支架，体内体外实验证明该支架具有良好的成骨能力[24]。尽管细胞来源的dECM涂层在支架材料上最大可能地模拟了骨组织再生的三维微环境，但是有研究认为直接将细胞培养在特定材料表面并不适用于各种各样的材料表面[15]，该方法在一定程度上限制了材料的应用。最重要的是，脱细胞处理是否会影响外源性支架与dECM界面处的稳定性，有待深入研究。

3.3 脱细胞膜片来源的dECM片层与生物相容性材料复合

有研究通过多巴胺化学技术使脱细胞膜片形成的dECM片层与钛片复合，形成了在纯钛表面涂层细胞膜片来源的dECM片层，深度解析了表面微形貌、纤维排列和成分，体外研究发现，该涂层促进骨髓间充质干细胞的增殖和成骨分化[15]。脱细胞膜片来源的dECM片层很大程度上保留了dECM的纤维排列结构和微观形貌及生物活性成分，尤其是保存dECM片层的结构完整性和大约相当于10%的新鲜细胞膜片生长因子的含量[4]。但是与外源性支架的复合是否因为外源性支架的存在可能掩盖了成骨效应的发挥有待进一步深入研究。

3.4 无外源性支架材料dECM的应用

有研究将成骨诱导后的骨髓间充质干细胞膜片经脱细胞处理后形成成骨诱导后的脱细胞外基质片层，含有大量的胶原成分及生长因子(BMP-2, VFGFs, TGF-β1, bFGF),并且具有骨诱导和骨传导特性，能显著促进大鼠股骨节段性骨缺损的修复[25]。最近一项研究将人类间充质干细胞膜片来源的脱细胞外基质接种软骨细胞，体外研究发现该支架能明显促进软骨细胞的增殖和提高软骨细胞表型。动物实验证实，将其接上软骨细胞后折叠形成3D结构，该结构能显著促进软骨再生[26]。尽管这种纯粹生物活性dECM支架的应用首先解决了外源性人工合成支架降解带来的系列问题，但是细胞来源的dECM支架可能存在着结构的不足和形状的不稳等问题。总之，不同应用形式的dECM支架存在着不同程度的优缺点，正是这些不同层面的缺陷推动着科研人员的认知不断进步，伴随着材料学、生物力学等学科的不断进步与发展，dECM在骨再生中应用中相关机理和应用形式有待深入研究与改进。

4 dECM在骨再生中的作用机理

4.1 生物活性成分发挥了重要的骨再生效应

生物活性成分例如纤连蛋白(fibronectin, FN)、Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ, Col-Ⅰ)、硫酸软骨素糖胺聚糖(Sulfated GAGs)发挥了举足轻重的骨再生效应 dECM的一个主要生物活性分子FN具有抑制破骨效应，可能的机理与抑制NF- κB信号通路和降低细胞内活性氧(ROS)有关[27]，此外，dECM尤其是Ⅰ型胶原可以提高间充质细胞内抗氧化酶水平，通过激活SIRT1依赖的信号通路提高间充质干细胞抵抗对氧化应激引起的细胞早衰[28]。在炎症状态中，Ⅰ型胶原可通过OSCAR介导的信号通路促进单核细胞来源的树突状细胞的成熟[29]。硫酸软骨素糖胺聚糖(Sulfated GAGs)在促进成骨细胞分化的同时通过上调OPG的表达来抑制破骨细胞分化[30]。dECM还可以通过ROCK Ⅱ通路增加肌动蛋白细胞骨架的张力来延续已分化间充质干细胞的成骨表型[31]。

4.2 生物活性分子的物理排列与表面微形貌对干细胞行为调控促进骨再生

亦有研究通过表征方面分析不同细胞来源的dECM的特殊蛋白的物理排列来解释不同的生物学效应[5]。表征分析研究发现：与软骨细胞来源的dECM相比，成纤维细胞来源的dECM中FN呈现空间紧密而又有序的排列，这种特定蛋白有序的物理排列，使得成纤维细胞来源的dECM能够明显上调成骨相关蛋白：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ,ALP),骨桥蛋白(osteopontin , OPN),骨钙素(osteocalcin, OCN)和Col-I，从而发挥dECM成骨生物学效应。改变dECM弹性模量和表面形貌通过激活FAK/RhoA/ROCK/MAPK信号轴调控干细胞行为[32]。dECM表面微形貌调控成骨分化的复杂机理也可能涉及Hippo信号通路中的两个蛋白成员：YAP和TAZ，细胞对dECM纳米拓扑结构的反应跟YAP和TAZ有关[33]。TAP和TAZ通过调控骨形成、改建和骨基质的机械属性发挥联合效应促进成骨[34]。目前关于dECM与TAP/TAZ之间的联系鲜有报道，相关机理需进一步深入研究。

4.3 dECM含有大量内源性生长因子

dECM为骨再生提供了含有丰富内源性生长因子的微环境，并且持续缓慢释放IGF-1等生长因子促进种子细胞的增殖和成骨分化[18]；而且由生物活性分子组成的三维空间结构的dECM可能又会更多的募集笼络缓释大量生长因子。

4.4 整合素介导的细胞与dECM之间的信息传递调控细胞的行为

整合素介导细胞在dECM上的粘附和迁移，整合素还能感知张力、空间构像及ECM组成的变化，在细胞与ECM之间起到双向信息传递作用，这种信息转换取决于整合素相关因子包括整合素类型、集群等[35]；不仅如此，整合素对细胞最初粘附到生物材料表面也起到重要作用[36]。有研究[37]发现预处理脱细胞支架表面，使支架表面含有特定粘附蛋白，能显著提高表达整合素α3β1，α6β1和α5β1的细胞对支架的再粘附能力，阐明了细胞表面整合素与dECM特定蛋白匹配对放大细胞生物学效应的重要作用。此外，整合素可通过Wnt信号通路调控细胞的分化，Wnt5a 提高整合素mRNA和蛋白的表达，进一步调控间充质干细胞的成骨分化[38]。ECM也可通过integrinα5、Akt、GSK-3β通路调控间充质干细胞成骨分化[39]。总之，dECM在骨再生中涉及到的机理极其复杂多样，不断深层次挖掘和认识dECM在骨再生中的机理，进一步优化dECM生物相容性材料，才能实现由基础研究到临床应用的转化。

5 细胞来源dECM的未来发展趋势

细胞来源的dECM材料在骨组织工程中的应用不仅实现了干细胞的“回收利用”，而且还制备了一种新型具有生物活性天然支架材料的雏形。但是，有研究报道彻底的脱细胞与相对不完全脱细胞处理，dECM生物活性并没有明显区别，过度脱细胞处理会削弱ECM的生物学功能[40]。因此针对更为有效和微创的脱细胞方法可能是未来的一个研究趋势。细胞来源的dECM结构纤维薄而脆弱，在不依赖外源性支架材料直接组装形成3D微结构的同时，胶原纤维结构容易破坏，因此，针对提升dECM胶原纤维结构强度的研究可能是未来的一个趋势。常规制备dECM生物活性材料无法实现个性化与精准化骨缺损修复，3D打印技术在生物材料中的应用实现了个性化与精准化的需求，因此，利用3D打印技术实现个性化与精准化dECM材料的制备有可能是未来骨缺损修复材料发展的趋势。