西藏2种乌头属药用植物茎内内生菌的分离与鉴定

马红梅 王璐璐 段双全

摘 要：目的：探究西藏工布乌头和露蕊乌头2种药用植物植株茎内内生菌。方法：采用培养基培养法和载玻片法对分离得到的菌株进行形态学分析，并利用分子生物学技术提取菌株DNA进行测定。结果：从2种西藏乌头属药用植物中获得的2株菌株，均属于半知菌亚门曲霉属环绕亚属黑色组的真菌。

关键词：西藏;药用植物;内生菌;DNA;乌头属

Abstract：Objective：This paper mainly explores the Isolation and identification of endophyte  in medicinal plant of Aconitum in Tibet. Methods：The strains of endophyte were isolated and analyzed morphologically by medium culture method and slide method. DNA of each strain was extracted by molecular biology technology for determination. Results：The two strains obtained belonged to the black fungus group of Aspergillus，Monilia-ceous，Hyphomycetales，Hyphomycetes，Deuteromycotina.

Key words：Tibet;Medicinal plants;Endophytes;DNA;Aconitum

内生菌（Endophyte）一词最早是由德国科学家de Bary首先提出的，早期定義是指生活在植物组织内的微生物。在长期的研究过程中，由于不同科研工作者研究的植物、角度、目的及得到的结论不尽相同，因此“内生菌”的概念和解释被多次修改。截至目前，普遍被认可的“内生菌”的概念是指生活史中某一时期生活在植物体内而其本身对植物组织不会引起明显病害症状的微生物类群。一般认为，植物内生菌与宿主互惠共生、协同进化。

近年来，随着生态学及医学研究的不断深入，国内外专家学者及相关的科研工作者对植物内生菌的研究越来越多。大量研究表明：植物内生菌在植物生命过程中起着十分重要的作用，主要体现在对植物的生长发育、次生代谢、应对生物胁迫等方面具有重要的作用[1]。目前，关于植物内生菌的研究已经渗透到医学、中药学、生态学、微生物学、植物病理学等多个学科领域。自Vogl于1898年成功从黑麦草（Lolium tu-melentum）的种子中分离得到第1株内生真菌以来[2]，已有很多研究者从不同植物中分离得到了不同种类的植物内生菌。众多的研究成果不仅丰富了内生菌种类，更加深了人们对内生菌的认识。目前，关于植物内生菌的研究和报道较多的是从不同植物内生菌内发现一些具有天然活性的代谢产物，主要包括萜类、黄酮类、内酯类、酚类、多肽类等[3，4]。可见，植物内生菌作为一种重要的微生物资源，是新型天然活性物质的重要来源之一。

西藏植物资源丰富，尤其是药用植物，其中乌头属植物在我国作为药材的应用已有很长的历史。据文献记载，乌头属植物的主要化学成分是乌头碱，并含有多糖、香豆素、黄酮、甾体等化学成分，具有调节免疫、麻醉止痛、抗炎和抗肿瘤等多重功效[5]。西藏现有乌头属植物73种，占全国乌头属植物总种数（含变种）的20.50%;该属资源的丰富度在全国范围内仅次于四川和云南，其中较明确的药用种类有13种，占西藏乌头属植物总种数的17.81%[6]。西藏乌头属植物主要分布在海拔2000～5000m的高山草甸、山坡石隙、砾石草坡和灌木丛林等地[7]。

目前，关于乌头属藏药研究较多的是在其化学成分及其结构以及生理活性等方面，尚未见对其内生菌的相关研究报道。植物内生菌按其种类一般分为内生细菌、内生真菌及内生放线菌3类。为探明西藏乌头属植物体内内生菌的存在及分类，本试验对西藏2种常见的乌头属植物工布乌头和露蕊乌头茎内内生菌进行了分离与鉴定，以期为今后该属植物资源的保护及乌头属藏药的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验样品 工布乌头和露蕊乌头属于毛茛目、毛茛科（Crassulaceae）、乌头属（Rhodio-la L.）的植物[8]。工布乌头和露蕊乌头植株，均采自西藏林芝市工布江达县米拉山东坡，海拔4410m（北纬29°53′6″、东经92°20′19″）。

1.1.2 培养基及制备方法 采用PDA培养基（葡萄糖10g、土豆200g、琼脂15g、蒸馏水），定容到1000mL。

1.2 试验方法

1.2.1 样品处理 取工布乌头和露蕊乌头的茎用自来水反复冲洗后，再用医用消毒水冲洗数遍，放入无菌操作台内灭菌30min。然后将植物的茎切成3～4cm的小段，再纵向切开放入盛有次氯酸钠溶液的烧杯中15min，之后分别用硫代硫酸钠、乙醇和无菌水进行冲洗[9]，置于PDA培养基中进行培养。

1.2.2 菌株的形态观察 将分离得到的菌株移至新的培养基中进行分离纯化，再将纯化后的菌株以点接方式，接种到新的PDA培养基中。待观察到培养基表面有菌丝生长时，用已灭菌的医用手术刀把培养基切成长和宽为2cm×2cm，之后移到已经灭菌的载玻片上，盖上盖玻片继续培养[10]，设置智能温控培养箱的温度为25℃，湿度为60%～80%的范围内，每2d观察1次孢子的发育情况。

1.3 纯化后菌株的分子生物学研究

1.3.1 菌株DNA的提取 挑取真菌菌丝添加到PBS缓冲液中，加入100U的Lyticase（sigma L4025），于37℃条件下破壁处理30min。之后用真菌基因组DNA快速提取试剂盒（此试剂盒由宝信生物有限公司提供，货号DN1112）提取基因组DNA，用于后续的基因扩增。

1.3.2 rRNA基因ITS区间片段的扩增 PCR反应体系（50μL）如表所示。

1.3.3 rRNA基因ITS区间片段序列的测定 人工配制1.2%的琼脂糖DNA胶，用凝胶电泳鉴定得到的扩增产物，使条带涌动，直至流动到适当位置时，找到在凝胶成像中的目的条带，将目的条带进行回收。DNA序列测序用的是回收到的目的条带。

1.3.4 rRNA基因ITS区间片段的系统发育分析 将北京博迈德基因公司所测得的ITS序列通过互联网提交到Genbank数据库，运用BLAST进行网上在线比对，得到相似较高的序列，并將其作为参考序列进行序列号登记，运用Clustal_X2.0软件进行比对。利用生物进化数据分析方法以及进化树软件对进化距离进行计算并建立系统发育的进化树。

2 结果与分析

2.1 菌株形态 在25℃温度条件下，工布乌头和露蕊乌头茎内均可分离得到黑色绒毛状菌株，能在14d后在PDA培养基上迅速生长繁殖，经多次分离纯化菌株，发现菌株菌落呈现黑色，其整体菌落形态较为疏松，且有较淡的霉味，经分析之所以散发出较淡的霉味，出现黑色粉末，是因为菌落表面有部分已经分化产生孢子，其分生孢子头部为黑色，顶囊的形状为球形或近球形，直径为30～45μm;分生孢梗茎光滑无色，近顶囊处略带有暗褐色;产孢结构为双层，并呈现出褐色;平梗是（8～10）μm×L2.5～3μm，壁的粗糙程度很明显，且具有不规则的脊状凸起或纵向条纹。

2.2 菌株的系统发育树 将工布乌头和露蕊乌头茎内提取得到的菌株的rRNA基因ITS区间序列提交到GenBank，得到登录号分别为GB6961294和GB6961295。通过用BLAST在线对序列做相似性分析。对于无法用人工判定的高覆盖率和高相似度比对结果，运用MEGA6.0和Clustal_X2.0软件构建系统发育树，得到菌株的聚类分析情况（见图3）。从图3可以看出，工布乌头和露蕊乌头内生菌菌株均归类于曲霉属环绕亚属（D）中的黑色组（C），2种乌头的内生菌菌株与黑曲霉亲缘关系最为接近。

3 讨论

本研究中，通过对采自西藏林芝市工布江达县米拉山东坡的工布乌头和露蕊乌头2种药用植物植株茎内内生菌的进行分离，得到菌株。通过查阅中国真菌志（第五卷）中相关内容得知，该菌株归属到曲霉属黑色组真菌的一种。然而，在菌株瓶梗和梗基形态上的描述与模式物种有所差异。另外，通过查阅真菌超微形态[11]、中国菌物和普通真菌学等文献，都将其列入曲霉属真菌;通过rRNA基因ITS间隔区序列进行发育分析，进一步确立了菌株在系统发育上的进化位置，属于曲霉属环绕亚属黑色组的一种真菌。本试验结果对于补充西藏乌头属药用植物内生菌的相关研究以及对藏药植物资源的保护和利用具有一定的意义。

植物内生菌是一个巨大的微生物新资源，具有重要的医药应用潜力。西藏植物资源丰富，尤其是药用植物资源丰富，生境特殊。因此，对西藏这种特殊生境下更多的药用植物内生菌的研究，包括其他的乌头属藏药植物内生菌的分离鉴定，可以为西藏新型藏药的开发利用提供一定的参考。

参考文献

[1]崔晋龙，郭顺星，肖培根.内生菌于植物的互作关系及对药用植物的影响[J].药学学报，2017，52（2）：214-221.

[2]邹文欣，谭仁祥.植物内生菌研究新进展[J].植物学报，2001，43（9）：881-892.

[3]华梅，肖支叶，原晓龙，等.10种植物内生真菌抗菌活性研究[J].福建师范大学学报（自然科学版），2018，34（2）：57-64.

[4]杨志军，邓毅，曼琼，等.内生菌在天然药物研究中的研究进展[J].中国临床药理学杂志，2018，34（5）：593-596.

[5]杨姝，金振辉，羊晓东，等.乌头属植物的化学成分及药理作用研究进展[J].云南农业大学学报，2007，22（2）：293-295.

[6]马景锐，薛辉，徐磊，等.西藏乌头属植物多样性研究及应用[J].广东农业科学，2015，20：26-33.

[7]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].北京：科学出版社，2004.

[8]吴征镒.西藏植物志[M].北京：科学出版社，1983：16-32.

[9]赫晓娟.植物内生菌[M].北京：中国农业科学出版社，2010：53-54.

[10]林晓明，李振岐，侯军，等.中国菌物[M].北京：中国农业出版社，2007.

[11]康振生，黄丽丽，李金玉.植物病原真菌超微形态[M].1版.北京：中国农业出版社，1997.

（责编：张宏民）