HPLC法测定银黄甘颗粒中金银花有效成分绿原酸的含量

2020-01-03郑雪媚

安徽农学通报 2020年23期

郑雪媚

摘要：目的：采用HPLC法测银黄甘颗粒中金银花有效成分绿原酸的含量。方法：测定色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（5u4.6×250mm），以乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90）为流动相，检测波长为327nm。结果：绿原酸在20～250?g/mL范围内线性关系良好，相关系数R2为0.9999;绿原酸的回收率为99.3%～100.5%;绿原酸的测定重复性RSD为0.3%。结论：该方法线性范围宽，分析时间短，样品前处理简便，定量结果准确，重现性好。

关键词：绿原酸;银黄甘颗粒;HPLC;含量测定

Abstract： Objective：HPLC determination of chlorogenic acid which is the effective component of honeysuckle in Yinhuanggan Granules. Methods：Determination of chromatographic conditions：column as C18（5u 4.6×250mm），mobile phase as acetonitrile -0.4%Phosphoric acid solution（10∶90，v/v），detection wavelength of 327nm.Results：chlorogenic acid showed a good linear relationship at range of 20～250μg/mL（R2=0.9999）.The recovery rate of chlorogenic acid was 99.3% to 100.5%.The RSD chlorogenic acid was 0.3% .Conclusion：This method showed a wide linear range of the determination，a short analysis time，simple pre-treatment of samples，quantitative results and a good reproducibility.

Key words： Chlorogenic acid; Yinhuanggan Granules; HPLC; Determination of content

金銀花含有绿原酸、异绿原酸、木犀草素、咖啡酰奎宁酸类等主要活性成分，主要药理作用在于：（1）抗炎作用。王林青等研究发现，金银花的提取物对于大鼠局部急性炎症有较好的抑制作用[1]。崔晓燕等研究表明，金银花有效成分能够显著抑制大鼠原代小胶质细胞NO释放，说明其具有抗炎作用[2]。宋建华研究表明，金银花对炎症模型小鼠的抗炎作用与其剂量呈明显正相关性[3]。（2）抗菌作用。赵良忠等实验显示，金银花能抑制金黄色葡萄球菌、肺炎双球菌的繁殖，说明金银花提取物具有较好抗菌作用[4]。金银花主要成分绿原酸、异绿原酸、木犀草素均有抑制铜绿假单胞菌的效果，抑制效果最强的是绿原酸;金银花有机酸组分与氨基糖苷类抗生素联合用药，能协同抑制铜绿假单胞菌多耐药菌株[5]。李平等研究显示，金银花对金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌有不同程度的抑菌效果[6]。李国喜等实验研究发现，金银花不同浓度水提液可以有效治疗人工感染鸡大肠杆菌病[7]。（3）抗病毒作用。马双成研究发现，金银花对呼吸道病毒有较强的抑制作用，其中绿原酸和咖啡酰奎宁酸类是其抗呼吸道病毒作用的主要活性物质[8]。李永梅研究发现，金银花醇提取液能增强细胞抗病毒感染的能力，其抗病毒效果显著[9]。此外，季志平等研究表明，金银花能降低病毒感染小鼠的肺指数值，且明显减轻感染实验动物的肺部病变[10]。（4）抗支原体作用。孙艳平等研究发现，金银花水提物具有明显抗肺炎支原体作用[11]。（5）免疫功能调节。周秀萍等研究发现，金银花水煎剂能明显提高巨吞噬细胞吞噬率及吞噬指数，其量增加时，机体的淋巴细胞转化率增强[12]。王妍实验研究证明，金银花水煎液可提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，同时也能促进小鼠淋巴细胞的转化，表明金银花具有明显免疫调节作用[13]。

本研究按照中国兽药典要求[14]，根据绿原酸的结构特点，建立测银黄甘颗粒中绿原酸含量的HPLC法。该方法具有线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好等优点，可为银黄甘颗粒的质量控制提供依据。

1 研究方法

1.1 试剂与仪器日本岛津SPD-20A液相色谱仪;柱温箱CTO-20AC;超纯水仪UPR-5T;超声波清洗器KQ-500DE;天平METTLER MS105DU;绿原酸标准品来源：中国食品药品检定研究院;水为超纯水，乙腈为色谱纯。

1.2 色谱条件流动相：乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），色谱柱：菲罗门C18 5u4.6×250mm，检测波长：327nm，流速：1.0mL/min，柱温：35℃，进样量：10?L。

1.3 对照品溶液的配制稀释液：流动相。对照储备液：精密称取绿原酸对照品51.9mg，置100mL棕色量瓶中，加50%甲醇使溶解至刻度，摇匀，作为绿原酸对照品贮备液。取对照储备液1.0mL到10mL容量瓶中，加稀释液定容，制成约51.9?g/mL的对照液。

1.4 样品溶液的配制取银黄甘颗粒适量，研细，取约0.5g，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加50%甲醇40mL，超声处理（功率500W，频率40kHz）30min，放冷，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.5 系统适用性试验取上述51.9?g/mL的对照溶液10?L分别按1.2。色谱条件下进样，测定并计算柱效、分离度和拖尾因子（具体数据见表1）。

1.6 线性试验取上述对照储备溶液分别稀释成20.05?g/mL、50.14?g/mL、100.27?g/mL、150.41?g/mL、200.54?g/mL、250.68?g/mL的系列对照品溶液，按1.2色谱条件测定，以峰面积对浓度进行回归，绿原酸峰面积的回归方程分别为：Y=27136X-102920（R5=0.9999），说明绿原酸在20～250?g/mL范围内具有良好的线性关系（具体见图1）。

1.7 重复性试验精密吸取同一供试品溶液，按1.2项色谱条件测定，进样6次，得绿原酸峰面积的RSD为0.3%，表明样品的重复性良好。具体如表2所示。

1.8 回收率试验精密取已知含量的同一批样品（含量为5.1mg/g）约0.25g（共9份）置于50mL容量瓶中，分别加入上述1.3.2项下对照储备液1.5mL、2.5mL、3.5mL，按上述1.4项要求处理，进样测定。样品绿原酸的平均回收率为99.9%。具体结果见表3。

1.9 供试品的测定取3批样品及标准溶液，按外标法测定，每批样品进样2次，计算样品中绿原酸含量（图谱见图2）。3批样品的含量测定结果分别为4.9mg/g、4.7mg/g、5.0mg/g。

2 结论

本试验建立了HPLC法测银黄甘颗粒中绿原酸含量的方法，测定色谱条件为：色谱柱为菲罗门C18 5u4.6×250mm，流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液（10∶90），流速为1.0mL/min，检测波长为327nm，在20～250?g/mL范圍内线性关系良好。该方法具有线性范围宽、分析时间短、样品前处理简便、定量结果准确、重现性好等特点，为其质量控制提供科学依据。

参考文献

[1]王林青，崔保安，张红英，等.中药金银花提取物抗炎作用研究[J].中国畜牧兽医，2008，35（8）：82-84.

[2]崔晓燕，董玫.金银花提取物含药血清对正常的及LPS刺激的大鼠原代小胶质细胞释放NO的影响[J].河北医科大学学报，2008，29（2）：245-248.

[3]宋建华.金银花解热抗炎作用的实验研究[J].重庆医学，2011，40（25）：2552-2553.

[4]赵良忠，蒋贤育，段林东，等.金银花水溶性抗菌物质的提取及其抑菌效果研究[J].中国生物制品学杂志，2006，19（2）：201-203.

[5]林小静，王岱杰，耿岩玲，等.金银花主要成分对铜绿假单胞菌多耐药菌株的抑制作用研究[J].食品与药品，2013，15（1）：12-15.

[6]李平，赵成.金银花水提物及醇提物体外抗菌实验[J].中国当代医药，2010，17（17）：48-50.

[7]李国喜，赵银丽.中药金银花对人工感染鸡大肠杆菌病的疗效试验[J].安徽农业科学，2006，34（20）：5259-5260.

[8]马双成，毕培曦，黄荣春，等.金银花药材中抗呼吸道病毒感染的咖啡酞奎宁酸类成分的定量研究[J].药物分析杂志，2005，25（7）：751-755.

[9]李永梅，李莉，柏川，等.金银花的抗腺病毒作用研究[J].华西药学杂志，2001，16（5）：327-329.

[10]季志平，朱萱萱，倪文澎，等.金银花提取物抗病毒的作用研究[J].中国医药导刊，2009，11（1）：92-93.

[11]孙艳平，焦晓黎，吴秉纯.8味中药提取物体外抗肺炎支原体的试验研究[J].陕西中医，2008，29（6）：727-728.