金荞麦提取物对猪肠道上皮屏障因子和炎症因子的影响

(1.安顺职业技术学院现代农业工程系，贵州 安顺 561000；2.贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 550025 )

炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease，IBD)是养殖畜禽的主要疾病，其发病机制多与肠黏膜屏障受损有关，是肠道中参与促炎、抗炎过程的细胞因子表达失调引发的免疫性疾病[1～3]。在养殖过程中畜禽发病一般采用抗生素进行治疗，但抗生素过多使用会产生耐药性，在畜禽产品中也会残留，进一步危害人类健康，因此研究者们一直在寻求可以代替抗生素治疗肠道疾病的药物。近年对中草药治疗肠道疾病的研究颇多。金荞麦(Poyigoumcymosum)别名苦荞麦，蓼科荞麦属多年生草本植物，可作为1种中草药，具有促进畜禽动物生长、防治疾病、提高肉品质和免疫功能等作用，采用不同提取液对其茎叶的提取物中均含有黄酮类化合物[4～8]。葛飞[9]等研究表明，金荞麦提取物对溃疡性结肠炎有抗炎作用，能抑制肠道中促炎性因子的表达。而金荞麦提取物对肠道炎症因子和肠道上皮屏障因子方面的研究较少。本研究旨在通过体外实验研究金荞麦提取物对肠道炎症因子和肠道上皮屏障因子的影响，为金荞麦治疗畜禽肠道疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地点贵州大学动物科学学院动物营养与饲料实验室、贵州大学新农村发展研究院农学实验室、广东省农业研究院。

1.2 材料金荞麦茎叶：采自毕节市织金县，晒干，经粉碎机粉碎后过40目筛。猪小肠上皮细胞(IEC)：购自广东吉妮欧生物有限公司

1.3 主要试剂胎牛血清(Gibco)、双抗、胰蛋白酶、DMEM/F12培养基(HyClone)，购自Giboco公司；Trizol 试剂、异丙醇、氯仿、DEPC水、DMSO、PBS粉，购自英俊生物；GoldenstarTMRT6 cDNA Synthesis Kit反转录试剂盒、荧光定量PCRmix，购自伯乐生物。

1.4 方法

1.4.1金荞麦提取物制备：准确称取金荞麦粉20 g，浸泡于60%乙醇，料液质量比为1∶12，于60 ℃超声波清洗器中超声处理1 h，再利用80-2型离心沉淀机以3 000 r/min离心5 min后收集上清液，放置78.5 ℃水浴锅中加热浓缩，再用烘干箱75 ℃进行烘干处理，最后得到提取物，冰箱保存备用。提取率(%)=提取物重量/样品重量×100% 。

1.4.2IEC的培养和处理：利用完全培养基DMEM/F12培养IEC，当IEC生长到80%～90%并且生长状况优良时，将细胞浓度调至到5×105个/mL，接种至6孔板，每孔1 mL，细胞贴壁生长24 h后加入DMEM/F12培养基，2 h后分别加入60%乙醇1 mL(金荞麦提取物浓度为0)及不同浓度的金荞麦提取物(10、50、100、250 μg/mL)，并设空白对照组，每组3个重复，孵育48 h后，检测肠道上皮细胞屏障因子ZO-1、Occludin 及肠道上皮细胞炎症因子TNF-α、IL-6、IL-8、IL-22、IL-10等基因的表达。

1.4.3荧光定量RT-PCR检测：Trizol法提取RNA，紫外分光光度计和电泳测定其含量、纯度及质量，1st-Strand cDNA Synthesis反应体系进行逆转录，把反转录获得的cDNA、目的基因和内参基因的上、下游引物sybrGreen qPCR mix 以及无菌水配制 20 μL反应体系，9700型PCR扩增仪(ABI，USA)进行荧光定量RT-PCR测定。反应条件：95 ℃ 预变性2 min；循环条件：95 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环反应。所用引物相关信息见表1。

表1 实时荧光定量RT-PCR引物

1.5 数据统计和处理对荧光定量RT-PCR的Cq值利用 2-ΔΔt法进行数据处理，应用SPSS软件对实验数据进行分析，采用单因素方差分析。

2 结果

2.1 金荞麦茎叶粉乙醇提取物金荞麦60%乙醇提取物为黑色块状或粉末状，见图1。20 g金荞麦叶粉可获得2.619 4 g提取物，提取率为13.10%。

图1 金荞麦提取物

2.2 不同浓度的金荞麦茎叶提取物对猪肠道上皮细胞炎症因子表达的影响由图2可见：TNF-α和IL-8的表达随金荞麦提取物浓度升高而降低，浓度达到50 μg/mL时显著下降(P<0.05)，在250 μg/mL时极显著下降(P<0.01)。IL-6的表达在浓度为0、10、50、100 μg/mL显著降低(P<0.05)，浓度为250 μg/mL时差异不显著(P>0.05)。IL-10和IL-22的表达在浓度为50 μg/mL时显著升高(P<0.05)，在浓度为250 μg/mL 时极显著升高(P<0.01)。

图2 小肠上皮细胞炎症因子的表达

注：图中标记相同字母为差异不显著(P>0.05)；不同字母为差异显著(P<0.05)。下图同

2.3 不同浓度的金荞麦茎叶提取物对猪肠道上皮细胞屏障相关基因表达的影响由图3可见：在金荞麦茎叶提取物浓度低于100 μg/mL时，ZO-1表达无显著性差异(P>0.05)，但表达均低于对照组；当浓度达到250 μg/mL时，ZO-1表达显著升高(P<0.05)。在浓度低于100 μg/mL时，Occludin表达较对照组差异不显著(P>0.05)；当浓度达到250 μg/mL时，Occludin显著升高(P<0.05)。

图3 肠道屏障相关基因的表达

3 结论

本试验结果表明，金荞麦茎叶60%乙醇提取物的提取率为13.1%。金荞麦提取物对猪肠道上皮细胞促炎性因子TNF-α、IL-8和IL-6的表达有抑制作用，对抗炎因子IL-10的表达有促进作用，浓度为250 μg/mL效果最好。此外，金荞麦提取物浓度达到250 μg/mL可显著提高猪小肠上皮细胞紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白的表达。因此，金荞麦提取物可以下调小肠上皮细胞炎症因子的表达，上调抗炎因子IL-10的表达，同时上调紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白的表达，抑制机体炎症反应，保护肠道黏膜。

4 讨论

本研究未对金荞麦提取物主要成分进行分析，但从赵炎军[10]等研究表明其提取物主要成分为黄酮类化合物，乙醇浓度在60%～70%为最适提取液浓度。唐艳芬[11]等研究认为金荞麦可以降低血清中TNF-α、IL-8和IL-6的表达。葛飞[9]等研究也表明金荞麦乙醇提取物能抑制促炎性因子TNF-α和IL-6的表达，促进抗炎性因子IL-10的表达，可有效抑制机体炎症反应。同时，唐艳芬[11]研究表明金荞麦乙醇提取物对小鼠结肠组织中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin蛋白有上调作用，认为金荞麦乙醇提取物通过干预NF-κB炎症通路，抑制炎症反应，进而保护肠道黏膜受损。这些研究结果与本试验结果相类似，而金荞麦乙醇提取物浓度在高于250 μg/mL对小肠上皮细胞的抗炎作用效果如何，确定其最佳浓度还有待于进一步研究。