荧光法测定水中叶绿素a的影响因素分析

巩元帅 宋静静2 古小超

(1.天津市生态环境监测中心，天津 300191；2.天津市环境保护科学研究院，天津 300191)

富营养化是国内河流湖泊普遍面临的主要环境问题，对藻类等浮游植物生长及藻华暴发具有重要的影响[1]。叶绿素a是藻类等浮游植物光合作用色素，是表征水体中浮游植物生物量的重要监测指标之一，广泛应用于河流湖泊水质评价和富营养化评价。目前叶绿素a 的测定方法有荧光法、分光光度法、高效液相色谱法、遥感法等，其中分光光度法是国内测定叶绿素a的标准方法，该方法测定简单，但人工提取叶绿素和测定过程较为繁琐[2]。与分光光度法相比，荧光法可以不受采样时间和地点的限制，消除取样、保存、测量过程中人为因素的影响，可实现现场大批量、连续快速测定叶绿素a的含量[3]。目前，在湖泊、海洋水质在线监测中，基于荧光法的叶绿素a监测仪应用较为广泛。

1 荧光法基本原理

叶绿素是一种酯类化合物，是由叶绿酸和甲醇、叶醇酯化反应而生成。叶绿素作为一种荧光物质，受光照后，其分子吸收了和它特征频率相一致的光，跃迁到能量较高的激发态，激发态不稳定，返回能量较低的基态时，释放相应的能量产生荧光。当叶绿素a经波长为450nm左右的蓝光照射后，会激发出波长为680nm左右的红光，通过检测激发光的荧光强度，来计算叶绿素a的含量[4]。

2 荧光法影响因素

2.1 外界环境因素的影响

2.1.1 浊度

荧光法是通过测定水样经过光照后产生荧光的强度计算叶绿素a的浓度。水样中颗粒物、悬浮物等物质会影响光在水样中的传播，使激发光和荧光发生反射、散射等，对荧光测定结果造成影响。研究表明，浊度对叶绿素a测定的影响主要分为悬浮物自身产生荧光的荧光效应及对光线遮挡的遮蔽效应，两者均会对荧光测定结果产生影响[5]。叶陈军等[3]探讨了荧光效应和遮蔽效应对测定结果的影响，并根据实测数据提供一种叶绿素荧光计基于浊度的修正方法，校准后的荧光值与真实叶绿素荧光值较为接近。

2.1.2 pH值

pH值是藻类生长过程中最重要的影响因子之一，pH值对微藻细胞生长和油脂积累的影响主要在于改变细胞膜电荷和营养物的离子化程度，进而改变细胞的活性。 水体中过酸过碱的环境条件会干扰藻类细胞对物质的吸收，影响其生长代谢活性及叶绿素产量，对荧光特性产生一定的影响。吕鹏翼[4]在研究pH值对叶绿素现场检测仪测定结果影响中发现，当pH值在中性范围内时，铜绿微囊藻测定值变化较小，酸性或碱性测定误差增大。薄香兰等[6]以小球藻为研究对象，研究不同pH值对其叶绿素荧光、叶绿素含量和细胞密度的影响，结果表明pH值为7时，荧光活性最高，pH值为9时，荧光活性下降。

2.1.3 水温

荧光物质的荧光强度受温度影响较大。当温度降低时，荧光物质分子跃迁吸收的能量越高，回到基态时，释放的荧光量子越高，荧光强度越高；温度升高时则相反[7]。藻类等浮游植物自身受环境温度影响较大，当温度变化时，活体藻结构、光合速率或叶绿体的微环境发生了改变，从而影响了叶绿素a的荧光特性。吕鹏翼等[8]研究了温度对斜生栅藻、蛋白核小球藻及铜绿微囊藻荧光强度的影响，并计算了温度系数，结果表明随着温度升高，3种活体藻荧光强度均下降。

2.1.4 水样浓度

荧光法测定溶液物质含量时，在一定浓度范围内荧光强度与溶液浓度成正比，可根据荧光强度换算出溶液中荧光物质的含量，对于浓度较高的溶液，荧光强度与浓度不成线性关系。当溶液浓度过高时，一方面会导致激发光透光性减弱，另一方面会发生荧光自猝灭和荧光再吸收现象，导致荧光强度降低[7]。所以，在利用荧光法现场测定水体中叶绿素a的浓度时，在藻类浓度较高时，需适当进行稀释处理。

2.1.5 其他色素

在藻类等浮游植物叶绿素分子中，除了叶绿素a，还存在叶绿素b和叶绿素c。其中叶绿素a和叶绿素b在化学性质上具有一定的相似性，两者的激发和发射光谱存在明显的重叠。因此，在利用荧光法现场测定水体中叶绿素a的浓度时，需对测定的荧光强度进行修正，扣除叶绿素b所产生的荧光强度。为提高测量精度，许多专家学者利用同步荧光法测定叶绿素a含量，研究表明，测定结果基本不受其他色素干扰。

2.2 拟合模型

荧光法测定水体中叶绿素a，一般采用标准工作曲线法进行计算，该方法简单，对于水质干净、常年变化稳定的水体，能较好地反映出荧光强度与叶绿素a浓度之间的关系。但在实际应用中工作曲线并非完全是线性的，对于复杂的水体，线性拟合会导致测定结果出现较大误差。因此，为解决这类问题，将偏最小二乘法、神经网络、支持向量回归等方法应用到模型拟合中。但这些方法计算较为复杂，在拟合过程中需要较多的测量数据，建立过程比较繁琐。

2.3 运行维护

在水质自动监测中，采用荧光法的叶绿素a在线监测仪进行监测，具有测定快捷、维护简单等特点，适用于饮用水、海洋叶绿素a的监测。但受水体中微生物影响，仪器表面容易附着浮游植物及动物，受其生命活动影响，会加速仪器老化，导致生物腐蚀 ，影响仪器测量的稳定性和准确性。在对仪器的日常维护工作中，根据运行要求，工作人员应及时清理仪器表面附着的微生物，使仪器保持干净。定期对仪器进行校准，开展实验室比对，确保仪器稳定运行。当发现仪器损坏时及时进行更换备件，保证监测数据的连续性和完整性。

3 结 语

荧光法在水质较好的水体中测定结果较为准确，当水质较差时，由于影响因子较多，荧光法测定误差则会增大。为减小环境因子对监测仪器的影响，应做好以下工作：ⓐ加强监测仪器维护，尤其在夏季，保持仪器表面清洁干净；ⓑ采用温度补偿、浊度补偿等方式，消除水温变化、悬浮颗粒等对叶绿素a测定结果的影响；ⓒ利用同步荧光等对测试方法进行优化，扣除叶绿素b对测定结果的影响；ⓓ在拟合模型建立过程中，对比研究偏最小二乘法、神经网络、支持向量回归等方法在叶绿素测定中的应用，提高计算结果准确度。

利用荧光法可快速实现水体中叶绿素a含量的测定，与实验室分光光度法相比，操作简单、时效性强，可节省人力、物力。随着地表水资源、海洋环境保护力度的不断加强，水体富营养化监测工作将愈加重要，荧光法在叶绿素a测定中的应用将越来越广泛。