基于Cu2+修饰Fe3O4磁性微球对尿液中左氧氟沙星吸附性能研究及应用

张博，贺茂芳，胡娅琪，韩禄，唐一梅，张育珍

(1.西安医学院 药物研究所，陕西 西安 710021；2.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021)

左氧氟沙星(Levofloxacin，LEV)是通过抑制细菌DNA旋转酶的活性，阻止细菌DNA的合成和复制而导致细菌死亡，在临床治疗、农牧养殖中被广泛使用[1-3]。目前，可用于检测左氧氟沙星的方法较多[4-8]，如紫外-可见分光光度法、荧光猝灭法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等，然而这些方法样品前处理繁琐、对目标分子选择性差、液-质联用实验成本高。为克服以上问题，本文制备Fe3O4@SiO2/IDA-Cu功能化磁性微球，并建立一种磁固相萃取-高效液相色谱法可对复杂生物样品尿样中左氧氟沙星特异性吸附富集，检测专属性强、便捷、可有效地降低样品基质的干扰。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

左氧氟沙星(纯度为99%)、肉桂酸(CIN，纯度为99%)、布洛芬(IBU，纯度为98%)均由武汉那拉白医药化工有限公司提供；乙腈、甲酸均为色谱纯；甲醇、无水乙醇、乙二醇、正硅酸乙酯(TEOS)、甲苯、3-(2，3-环氧丙基)丙基三甲基硅烷(KH-560)、亚氨基二乙酸(IDA)、无水三氯化铁、柠檬酸三钠、盐酸、氨水均为分析纯；空白尿液由健康受试者提供；实验用水为超纯水。

DIONEX P680A型高效液相色谱仪；PB-10型酸度计；CPA225D型电子分析天平；SQP QUINTIX24-1CN型精密分析天平；JTF-100PPL型水热合成反应釜；TS-211B型气浴摇床；SB-5200DTD型超声波清洗器；DZF-6020型真空干燥箱；T09-1S型恒温磁力搅拌器。

1.2 实验方法

1.2.1 功能化磁性微球的制备 查阅相关文献[9-12]，优化部分实验条件，采用溶剂热法合成Fe3O4磁性粒子。称取适量上述磁性粒子，超声分散于20%柠檬酸三钠溶液中并静置2 h，磁性分离，转移至三颈瓶，加入水和无水乙醇，搅拌并超声分散45 min，再加入适量浓氨水，超声分散15 min，逐滴加入正硅酸乙酯(TEOS)，搅拌反应12 h，磁性分离，依次用水、无水乙醇交替清洗粒子3次，50 ℃减压干燥，即得到棕褐色Fe3O4@SiO2磁性微球。

取0.5 mL的KH-560，加入到10 mL无水甲苯中即为溶液Ⅰ。称取适量Fe3O4@SiO2磁性微球于三颈瓶中，加无水甲苯50 mL，超声分散10 min后110 ℃回流，缓慢滴加溶液Ⅰ，搅拌反应12 h后，磁性分离。依次用甲苯、无水乙醇清洗粒子3次，即得到Fe3O4@SiO2@环氧基磁性微球。

在100 mL三颈瓶中，分别加入上述微球和纯化水适量并超声分散，再加入IDA溶液(无水碳酸钠溶液溶解)调pH值为8.5，在80 ℃下油浴反应12 h，磁性分离后置于50 mL离心管中，加入5 mmol/L的CuSO4溶液，在25 ℃下孵育3 h，反应结束后用蒸馏水清洗磁性微球2次，50 ℃减压干燥，即得Fe3O4@SiO2/IDA-Cu磁性复合材料。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温25 ℃，流动相：乙腈∶0.1%甲酸水溶液=15∶85，流速1.0 mL/min，检测波长264 nm，进样体积20 μL。

1.2.3 对照品储备液配制 精密称取50.29 mg左氧氟沙星，置于100 mL容量瓶内，加入纯化水稀释至刻度，摇匀，即得0.497 9 mg/mL左氧氟沙星对照品储备液。

精密称取10.64 mg布洛芬，置于100 mL容量瓶内，加入纯化水稀释至刻度，摇匀，即得0.104 3 mg/mL 布洛芬对照品储备液。

精密称取40.17 mg肉桂酸，置于100 mL容量瓶内，加入纯化水稀释至刻度，摇匀，即得0.397 7 mg/mL 肉桂酸对照品储备液。

1.2.4 供试品溶液配制 精密吸取1.2.3节左氧氟沙星储备液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加纯化水稀释至刻度，即得浓度为49.79 μg/mL的左氧氟沙星对照品溶液。

精密吸取尿液2.0 mL，转移至50 mL具塞塑料离心管中，加入上述左氧氟沙星对照品溶液0.5 mL，加纯化水稀释至50 mL，再称取1.2.1节Fe3O4@SiO2/IDA-Cu磁性微球约30 mg，加至离心管中，气浴摇床25 ℃吸附30 min，磁性分离，5%氨水-甲醇溶液0.4 mL振荡洗涤2次，合并2次洗脱液，并定容至1.0 mL，用0.45 μm微孔滤膜过滤，HPLC分析。

1.2.5 阴性对照溶液配制 参照1.2.4节实验步骤，不加左氧氟沙星对照品溶液，制成阴性对照溶液。

2 结果与讨论

2.1 吸附-解吸附性能考察

2.1.1 磁性微球用量对吸附容量的影响 精密吸取尿液5份各2.0 mL，分别置于5支50 mL离心管中，加入1.2.4节左氧氟沙星对照品溶液各 0.5 mL，再依次加入20，25，30，35，40 mg的磁性微球。按照1.2.4节步骤进行吸附实验，按照1.2.2节色谱条件分析，以峰面积判断吸附容量与磁性微球用量之间的关系，结果见图1。

图1 洗脱液色谱峰面积与磁性微球用量的关系Fig.1 Relationship between peak area of elution chromatography and magnetic beads dosage

由图1可知，磁性微球用量20～30 mg时，左氧氟沙星测定的峰面积快速变大，而用量超过30 mg时，峰面积变化趋于稳定，显示不能进一步提高吸附容量，因此后续实验磁性微球用量定为30 mg。

2.1.2 吸附时间对吸附容量的影响 精密吸取尿液2.0 mL 5份，每份加入30 mg的磁性微球，按照1.2.4节步骤操作，分别吸附10，20，30，40，50 min，以峰面积判断吸附容量与吸附时间之间的关系，结果见图2。

图2 洗脱液色谱峰面积与吸附时间的关系Fig.2 Relationship between peak area of elution chromatography and adsorption time

由图2可知，当吸附30 min时，吸附容量达到最大值。

2.1.3 洗脱溶剂的组成对解吸附的影响 按照1.2.4节步骤操作，分别加入0，2%，5%，10%，20%氨水-甲醇溶液洗脱，对比5种不同洗脱结果的色谱峰面积，结果见图3。

图3 洗脱液色谱峰面积与洗脱溶剂的关系Fig.3 Relationship between peak area of elution chromatography and eluting solvent

由图3可知，浓度在5%以上氨水-甲醇溶液并不能快速显著的提高洗脱效率，可能是因为左氧氟沙星、氨水和Cu2+竞争性吸附趋于平衡，所以确定5%氨水-甲醇溶液洗脱效果最佳。

2.1.4 洗脱时间对解吸附的影响 称取30 mg磁性粒子4份，按照1.2.4节步骤操作，第1次洗脱10，20，30，45 min，结果显示30 min洗脱效果最佳，继续对该份样品进行第2次洗脱，分别洗脱10，15，30 min，结果显示15 min基本洗脱完全。最终确定为2次洗脱，第1次30 min，第2次15 min，结果见图4。

图4 洗脱液色谱峰面积与洗脱时间、洗脱次数的关系Fig.4 Relationship between peak area of elution chromatography and elution time，elution times

2.2 方法学考察

2.2.1 作用机制与专属性考察 左氧氟沙星药物分子结构中3，4位分别为羧基和酮羰基，易与金属离子形成配位化合物，而肉桂酸、布洛芬等其它药物分子结构中没有此结构，因此这些物质不能与Cu2+发生该配位反应。所以可以推断，制备的Fe3O4@SiO2/IDA-Cu可以特异性的吸附左氧氟沙星。

精密吸取空白尿液2.0 mL，加入1.2.3节左氧氟沙星、肉桂酸与布洛芬对照品溶液各0.2 mL，按照1.2.4节操作制备供试品溶液，另取1.2.5节阴性对照溶液，并按照1.2.2节色谱条件，结合梯度洗脱分析，0～5 min乙腈∶0.1%甲酸水溶液=15∶85，5～30 min乙腈∶0.1%甲酸水溶液=50∶50，30～50 min乙腈∶0.1%甲酸水溶液=50∶50，色谱分析结果见图5。

图5 专属性考察色谱图Fig.5 Chromatogram of specific investigation test

a.混合液中左氧氟沙星、肉桂酸与布洛芬色谱图；b.洗脱液中左氧氟沙星色谱图；c.阴性对照色谱图

结果表明，本文中制备的磁性微球，在复杂样本体系中可选择性的吸附左氧氟沙星而布洛芬与肉桂酸无干扰，专属性良好。

2.2.2 线性关系考察及检出限、定量限 将左氧氟沙星对照品储备液稀释成浓度为0.50，1.99，4.98，19.92，49.79，99.58 μg/mL的系列标准溶液，并按照1.2.2节色谱条件，进样分析，以标准溶液浓度(mg/mL)为横坐标，峰面积为纵坐标，求得回归方程及相关系数为y=0.794 2x-0.296 1，r=0.999 8，表明线性关系良好，线性范围0.5～99.58 μg/mL，分别以3倍、10倍信噪比(S/N)计算得出检出限(LOD)为0.2 μg/mL和定量限(LOQ)0.5 μg/mL。再以19.92 μg/mL的标准溶液为分析对象，按照1.2.4节分析，计算得精密度RSD为1.93%。

2.2.3 加标回收率 精密吸取6份尿液各2.0 mL，按照1.2.4节方法制备供试品溶液，再分别加入低、中、高三个不同浓度的左氧氟沙星溶液，按照1.2.2节色谱条件分析，结果见表1。

表1 加标回收率实验结果Table 1 Experimental results of spiked recoveries

由表1可知，平均回收率为95.85%，RSD为1.97%，表明该方法的回收率良好。

2.3 样品测定

精密吸取空白尿液5份，各2.0 mL，分别转移至5个50 mL离心管中，按照1.2.4节步骤制备供试品溶液，同时按照1.2.2节色谱条件进样分析，分别记录峰面积，并计算回收率，结果见表2。

表2 尿液样本含量测定结果Table 2 Test results of five human serum samples

3 结论

本文制备了一种新型功能化Fe3O4@SiO2/IDA-Cu磁性微球材料，通过大量的吸附-解吸附性能考察实验，对影响吸附-解吸附性能的主要因素进行了研究，进而优化实验条件，并对尿样中左氧氟沙星进行萃取、富集和检测，获得满意的结果。

(1)在样品前处理过程中，分别对不同样品进行了萃取、富集，研究了经Cu2+修饰的磁性微球对左氧氟沙星的选择性吸附机理。

(2)将Cu2+键合在Fe3O4磁性微球表面，使其表面金属亲和活性增加，选择性吸附性能增强，联合高效液相色谱仪建立MSPE-HPLC法，可有效降低尿液中基质的干扰，富集微量乃至痕量的左氧氟沙星，为复杂生物样本检测提供了方便、快捷、低成本的检测新方法。