纯氧和空气肺通气下基因差异表达与肺损伤的关系
2020-01-01李云涛张红波聂小虎韦鹏翔
陈 超 李云涛 张红波 沈 亮 聂小虎 韦鹏翔
1.湖州市中心医院 湖州师范学院附属中心医院麻醉科，浙江湖州 313000；2.湖州市中心医院 湖州师范学院附属中心医院神经外科，浙江湖州 313000；3.南方医科大学珠江医院神经外科，广东广州 510000；4.南京医科大学附属常州第二人民医院神经外科，江苏常州 213000；5.广西壮族自治区北海市人民医院神经外科，广西北海 536000
肺通气是肺与外界环境之间的气体交换过程，是肺复苏、急性呼吸窘迫综合征、全麻手术等维持血氧含量的常用方法。低潮期量、单肺通气、呼气末正压通气等不同的肺通气形式可影响通气后肺损伤程度［1-4］。高氧浓度肺通气也是导致肺损伤的重要危险因素［5］，而目前对高氧浓度肺通气的氧化应激损伤的机制知之甚少。氧化应激损伤可以通过产生活性氧自由基（ROS）和活性氮自由基（RNS）引起细胞结构的破坏和功能的受损。氧化应激是导致肺损伤的重要危险因素［6-8］，是肺通气损伤的重要机制之一，而控制氧化应激损伤可以保护肺组织［9］。肺组织氧化应激损伤程度又与氧浓度相关［10-11］，高浓度的氧气进入机体后，脂质的过氧化、氧自由基的产生可以损伤肺组织线粒体，破坏膜结构和损伤细胞功能。因此，氧化应激损伤在肺通气损伤过程中具有重要的研究价值，进一步研究不同氧浓度对肺通气过程中肺损伤的影响及其可能的机制，可能为未来肺通气模式的选择提供新的思路。
1 资料与方法
1.1 数据来源
本研究的芯片数据（GSE489）均来源于GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/），包含5 只大鼠（褐家鼠）的数据，以空气（氧含量21%）通气为对照组（n=2），纯氧（氧含量100%）通气为实验组（n=3）。
1.2 差异基因筛选
采用R（3.5.1 版）软件调用“limma”包分析两组存在差异表达的基因，设置基因表达差异倍数的绝对值＞2，P ＜0.05 即定义为差异基因。
1.3 基因功能富集分析
差异基因导入DAVID（6.8 版）进行基因注释及功能富集分析，主要采用GO 功能富集分析中生物学过程（biological process，BP）、细胞成分（cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3 种类别的分析，选择错误发现率（FDR） ＜0.05 的功能富集并进一步分析可能与肺损伤有关的基因。
1.4 蛋白质-蛋白质互作网络构建及数据可视化
采用在线工具STRING（11.0 版）对差异基因进行多蛋白关联分析，从已知相互作用、预测相互作用和文本挖掘等3 个方面构建蛋白间网络，最低互作评分值选择中度可信（0.400）。对功能富集分析结果的adj.pval取对数，绘制柱状图；根据富集分析数据匹配基因表达量绘制圆圈图、和弦图。
2 结果
2.1 差异基因分析结果
共得到差异基因140 个，其中上调基因56 个，下调基因共84 个。见图1。
图1 两组差异基因热图
2.2 差异基因功能富集及可视化
差异基因共获得FDR ＜0.05 的功能富集6 项，见图2，功能富集中与肺损伤可能相关的包括线粒体、线粒体呼吸链复合体Ⅰ、同源二聚蛋白激活，富集分析结果中以低表达基因出现多见，该现象在线粒体、线粒体呼吸链复合体Ⅰ中最突出，其中线粒体呼吸链复合体Ⅰ均为低表达基因（图3），分别是NDUFB3、NDU FA4、NDUFB1、NDUFB9、NDUFB10、NDUFC1、NDUFC2基因。
和弦图中共有52 个基因参与线粒体、线粒体呼吸链复合体Ⅰ、同源二聚蛋白激活3 项功能，其中与线粒体有关的基因有35 个，与同源二聚蛋白激活有关的基因20 个，与线粒体呼吸链复合体Ⅰ有关基因有7 个。见图4。
图2 GO 分析柱状图
图3 各项功能富集结果中上、下调基因的分布情况
2.3 蛋白质-蛋白质互作网络构建
差异基因在STRING 中存在蛋白网络结构并形成不同的基因功能簇，见图5A，其中蓝色部分基因簇网络结构复杂，关键基因有NDUFA4、NDUFB3、NDUFB9、NDUFB10、NDUFC1、NDUFC2、CYC1 等，见图5B，与和弦图中线粒体呼吸链复合体I 的基因簇高度相似。
图4 和弦图中各个基因参与的功能富集分布
图5 蛋白质-蛋白质互作网络构建图
3 讨论
肺内氧化应激损伤的来源不仅仅是外源性，也可以是内源性，研究发现［10-11］，不同的氧浓度是影响肺损伤的重要因素。纯氧肺通气有扩张萎陷不张的肺组织、改善氧合、减少肺泡剪切力等优点，但是大量氧气瞬间涌入会造成氧自由基的大量释放，激活严重的氧化应激反应，造成肺组织的氧化应激损伤［12］。为进一步研究氧化应激肺损伤的机制，本研究通过生物信息的分析手段比较纯氧和空气通气两种条件下基因差异表达，并发现线粒体及线粒体呼吸链复合体Ⅰ是肺损伤发生的重要部位。
在线粒体内发生递电子反应的4 个呼吸链复合体（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）中，复合体Ⅰ蛋白结构最复杂，是ATP 来源最多的复合体［13-14］，但也是产生ROS 的主要部位，线粒体中递电子传递系统通过NADH-泛醌氧化还原酶的作用转变为ROS 和自由基，ROS 和自由基使生物膜发生脂质过氧化，破坏膜的正常结构，改变膜的通透性、流动性，从而影响膜的生物学功能［15］。复合体Ⅰ不仅是形成自由基的部位，也是对自由基损害特敏感的部位。ROS 和自由基是通过抑制线粒体电子传递链中复合体Ⅰ的活性发挥毒性作用，当其活性被抑制后会导致膜的脂质发生过氧化损伤，最终导致细胞ATP 获取障碍而死亡［16］。呼吸链中80%的复合体Ⅰ都是以超级复合体（例如复合体Ⅰ/Ⅲ）形式存在，因此复合体Ⅰ是呼吸链中超级复合体的必要组成部分［17］。
本研究结果显示，纯氧通气后线粒体复合体Ⅰ中的7 个差异基因（NDUFA4、NDUFB1、NDUFB3、NDUFB9、NDUFB10、NDUFC1、NDUFC2）均出现低表达现象，而这些基因与介导激活氧化调控［18］、清理氧化代谢产物［19］、维持正常的线粒体功能［20］等生物学过程相关。此外，STRING 分析工具从蛋白水平进行了外部验证，结果获得了与和弦图高度类似的基因聚集现象。纯氧通气后，氧自由基和ROS 这些具有细胞毒性的自由基抑制了肺组织内线粒体呼吸链复合体Ⅰ的活性，使具有传递电子功能的7 个基因出现表达水平下降，从而使线粒体的结构发生损害，组织细胞因供能障碍而死亡。除了潮气量可以影响食管癌患者肺损伤程度外［21］，有学者报道不同氧浓度通气对食管癌患者肺损伤影响存在差异，而具体机制尚不明确［22］。肺保护的机制研究需要关注分子水平［23-25］，本研究从基因水平提出纯氧通气可能是导致肺损伤的机制，可以进一步探索不同氧浓度通气与肺损伤的关系。
总之，高氧含量通气下的肺损伤主要是抑制线粒体呼吸链复合体Ⅰ的电子传递，电子漏出后影响线粒体ATP 的合成。NDUFA4、NDUFB1、NDUFB3、NDUFB9、NDUFB10、NDUFC1、NDUFC2 基因是氧化应激损伤的主要差异基因，在肺损伤过程中发挥了重要的功能，但本研究基于生物信息分析结果，需进一步的实验验证。
