MTHFR C677T基因多态性与脑小血管病认知功能障碍的相关性研究

汪明玉，张立辉，周浩，赵勇

脑小血管病（cerebral small vessel disease，CSVD）属于隐袭性脑血管疾病之一，可导致隐匿性卒中、认知功能障碍、痴呆及步态障碍等临床疾病和症状。近年来，CSVD作为认知障碍的重要病因，越来越受到关注[1]。尽管CSVD是导致人群认知功能下降的一个重要因素，但其确切的发病机制目前尚不清楚[2]。研究者认为腔隙性梗死灶、微梗死、血管周围间隙扩张、神经髓鞘脱失、脑动脉硬化、脑淀粉样血管病变等神经影像学及神经病理学改变都是CSVD认知功能障碍的早期表现，但这些改变都缺乏特异性[3]。因此，探索有效的CSVD早期检测指标为干预性治疗提供机会，是十分必要的。高同型半胱氨酸血症（hyperhomocysteinemia，HHcy）与CSVD 认知功能障碍的相关性已经得到实验研究的证实，但是由于影响外周Hcy混杂因素较多，其准确性受到质疑。近年来，已有研究发现Hcy相关基因MTHFRC677T基因的突变与CSVD的发病相关[4-5]，而基因检测可以有效避免各种血管病混杂因素的影响。基于此，本文就MTHFRC677T基因与CSVD认知功能障碍的相关性进行研究。

1 研究对象与方法

1．1 研究对象 连续入组2017年12月-2019年3月就诊于潍坊市人民医院神经内科的门诊及住院CSVD患者进行前瞻性研究，CSVD影像学诊断标准参照《中国脑小血管病诊治共识》[6]。

入组标准：①年龄50～85岁；②颅脑MRI检查显示新发的小的皮质下腔隙性梗死、可能为血管起源的腔隙、可能为血管起源的脑白质高信号、血管周围间隙、脑微出血的CSVD患者；③未服用过影响认知功能的药物；④患者本人或其家属能配合神经心理学检查；⑤患者或其家属签署知情同意书。

排除标准：①大面积皮质或皮质下梗死者及多发性硬化、颅内肿瘤等可能引起脑白质高信号者；②严重的视力、听力障碍，严重失语或肢体功能障碍而影响检查者；③由脑血管病以外的其他原因导致的认知障碍（如帕金森病、癫痫、精神病史、甲状腺功能低下、酒精依赖或药物滥用等）；④严重心脏、肝脏及肾功能不全者；⑤重度痴呆，临床痴呆评定量表（clinical dementia rating，CDR）为3分者；⑥服用对Hcy代谢有影响的药物者。本研究获得潍坊市人民医院伦理委员会批准。

1．2 分组 纳入研究的CSVD患者认知功能障碍诊断及分级参照蒙特利尔认知评估量表（Montreal cognitive assessment，MoCA）评分及CDR评分。根据MoCA评分及CDR评分进行分组。MoCA评分≥26分（CDR评分=0分）者为认知功能正常组；MoCA评分20～25分（CDR评分=0分）者为轻度认知功能障碍组；MoCA评分＜20分（CDR评分=0．5～2分）者为痴呆组。MoCA及CDR量表均由经过神经心理量表培训的神经内科医师完成。

1．3 研究方法

1．3．1 基线资料 记录所有入组患者的年龄、性别、受教育年限、吸烟（连续或累积吸烟≥6个月）、饮酒（每月饮酒量＞1．5 kg，连续1年以上者）、婚姻状况等资料及高血压、糖尿病等危险因素[7]。所有入组者清晨空腹采集肘静脉血，采用罗氏全自动生化分析仪，检测血清Hcy、TC及TG水平。Hcy≥17 μmol/L，为HHcy。高胆固醇血症为TC＞6．3 mmol/L，高三酰甘油血症为TG＞1．82 mmol/L。

1．3．2 磁共振检查 使用Siemens MAGNETOM Spectra Skyra 3．0T磁共振扫描仪进行头颅M R I检查。由2 名接受过神经影像培训的神内科医师评定，意见不一致时会商确定。MRI检查序列包括：①横断面快速梯度回波（fast field echo，FFE）T1WI；②快速自旋回波（turbo spin-echo，TSE）T2WI；③FLAIR T2WI；④增强T2加权血管成像序列（enhanced T2star-weighted angiography，ESWAN）3D梯度回波（gradient echo，GRE）序列。

1．3．3MTHFRC677T基因多态性检测 ①样本的制备：采集空腹静脉血2 mL于乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，ED TA）抗凝管中，并用DNA纯化提取试剂盒提取基因组DNA。根据限制性片段长度多态性聚合酶链反应（polymerase chain reactionrestriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）技术及Hinf1限制性内切酶片段长度进行MTHFR基因多态性分析。②PCR扩增：向MTHFR扩增液中加入Taq酶、基因组DNA，混匀，然后进行PCR扩增。③杂交、显色：将MTHFR基因芯片放入杂交仪片架中，将杂交缓冲液及PCR扩增产物，混匀制成杂交反应液，加入试管中，放入杂交仪运行杂交程序；反应结束后，取出芯片，将芯片放入生物芯片识读仪中用基因芯片图像分析软件进行图像扫描和数据分析。④基因亚型的判断：限制性内切酶将C677T 198bp PCR产物酶切后，野生型677CC有198bp片段，杂合突变型677CT有2个基因片段：198bp和175bp，纯合突变型677TT产生175bp片段。

1．4 统计学方法 采用SPSS 17．0进行统计分析，计量资料符合正态分布，用表示，整体比较采用方差分析进行检验，两组间比较采用LSD-t检验方法。计数资料用率表示，采用χ2检验进行分析。血清Hcy水平、MTHFR基因多态性与CVSD认知功能障碍相关性用Pearson相关检验。P＜0．05为差异具有统计学意义。

2 结果

2．1 一般资料 研究共纳入130例患者，其中男性87例（66．9%）。认知功能正常组63例，轻度认识功能障碍组35例，痴呆组32例。3组CSVD患者在年龄、性别、受教育年限、婚姻状况等基线资料方面的比较，差异无统计学意义（表1）。3组血清Hcy水平整体差异有统计学（P＜0．001），进一步两两比较显示，痴呆组患者血清Hcy水平高于轻度认知功能障碍组（P＜0．001）和认知功能正常组（P＜0．001），轻度认知功能障碍组Hcy水平高于认知功能正常组（P＜0．001）。

表1 3组脑小血管病患者基线资料的比较

2．2 血清同型半胱氨酸与认知功能障碍的相关性 Pearson相关检验显示血清Hcy水平与认知功能障碍正相关（r=0．626，P＜0．001）。

2．3MTHFRC677T基因多态性与认知功能障碍的相关性 对认知功能正常组、轻度认知功能障碍组和痴呆组患者基因型进行检验发现，3组基因型分布不同（χ2=19．265，P=0．001）。3组间基因型进行相关分析，MTHFR677 C→T基因突变与CSVD患者认知功能下降程度正相关（r=0．359，P=0．001）（表2）。

对3组患者MTHFRC677T等位基因进行检验发现，认知功能正常组、轻度认知功能障碍组和痴呆组C等位基因频率分别为72．2%、48．6%、40．6%，T等位基因频率分别为27．7%、51．4%、59．3%；C等位基因与T等位基因在整体中的分布差异有统计学意义（χ2=23．103，P＜0．001）。3组患者等位基因进行相关性比较，T等位基因频率与CSVD患者认知功能障碍弱正相关（r=0．273，P＜0．001）。

3 讨论

CSVD是指颅内小静脉、小动脉、毛细血管、微动脉等小血管病变导致的疾病，为涉及临床、病理及神经影像学改变的一系列综合征，与卒中及认知功能下降的风险密切相关[8]。CSVD的诊断主要依靠结构性MRI技术，其典型影像学特征包括脑白质高信号、脑微出血、血管周围间隙、新发的小的皮质下腔隙性梗死等[9]。年龄、性别、吸烟、高胆固醇血症、高血压、糖尿病等都被证实是CSVD的传统危险因素。近年来，有研究发现HHcy主要影响颅内小血管，是CSVD的独立危险因素[10]。Hcy作为蛋氨酸及半胱氨酸代谢重要的中间产物，其可能造成血管损伤的机制包括：首先，Hcy可能诱导血管内皮细胞基质金属蛋白酶-2的过度表达，而后者可以通过损伤血管基质而破坏血脑屏障[11-12]；其次，Hcy可诱导活性氧自由基、二甲基精氨酸等物质，抑制血管内皮细胞一氧化氮的分泌，从而进一步损伤内皮细胞结构和功能，引起血管壁重构等一系列改变，最终导致脑深部白质和基底节区核团缺血[13-14]。这一系列反应最终导致了CSVD的发生及发展。

表2 3组MTHFR基因多态性的比较

CSVD可导致以执行功能、语言、视空间能力、信息处理速度为主的认知功能的下降，且认知功能障碍程度与CSVD评分正相关[15]。作为CSVD的独立危险因素，已有大量研究证明，HHcy与CSVD的认知功能障碍密切相关，HHcy可引起CSVD各亚型患者认知功能的下降[16]。有大型队列研究发现，HHcy与认知功能下降程度正相关[17-18]。有研究发现，HHcy可引起全脑、海马及皮层等部位体积缩小，从而认为脑萎缩可能是HHcy导致认知功能下降的中间因素。研究者认为，一方面HHcy通过氧化应激等作用使脑小血管内皮细胞受损、细胞凋亡，最终导致动脉粥样硬化而引起脑白质变性或隐匿性无症状性脑梗死[19]；另一方面HHcy会通过诱导钙离子超载及大量氧自由基生成等，引起tau蛋白过度磷酸化，使得β-淀粉样蛋白沉积，进一步加速神经元的凋亡，而这两者均是认知障碍发生的重要原因[20]。

MTHFR是Hcy代谢过程中的一个关键酶，可以维持生物体内Hcy的正常水平。MTHFR677 C→T基因突变可以导致HHcy[21]，当发生突变时，MTHFR基因第677位点上胸腺嘧啶（T）取代胞嘧啶（C），导致该基因所编码的丙氨酸转变为缬氨酸，这一改变降低了MTHFR的活性，酶活性的降低导致了Hcy浓度的升高，最终引起了脑血管病及神经退行性疾病的发生[22]。基于此，MTHFRC677T基因多态性与CSVD的相关性得到了广泛关注与研究。有研究者对多项大型实验研究进行了汇总分析，证实MTHFRC677T基因多态性与CSVD发病密切相关，且证明TT基因型是CSVD的独立危险因素[23]。

本研究显示，CSVD患者中轻度认知功能障碍组与痴呆组患者MTHFRC677T基因突变（TT）基因型和T等位基因频率均显著高于对照组，提示MTHFR677基因C→T突变可能是CSVD患者认知功能损害的危险因素。进一步分析显示T等位基因频率与认知功能损害程度正相关，提示MTHFRC677T的T等位基因可能是CSVD患者认知功能障碍的危险因素。同时，痴呆组患者Hcy水平显著高于轻度认知功能障碍组及认知功能正常组，与之前的研究结果是一致的。

既往研究证实，维生素B12及叶酸缺乏可以加重HHcy对认知功能障碍的损害，所以早期发现和用药可以预防及减轻其对认知功能障碍的影响。但由于Hcy水平受高血压、年龄等多种因素影响，所以结果准确性有一定程度的误差。而本研究中的MTHFRC677T基因水平测定可以避免混杂因素的影响，准确度及灵敏度更高。能更好地预测认知功能损害的易发人群，给予早期干预，或可预防认知功能障碍的发生及进展。但本研究未对CSVD各影像学亚型进行详细分类，因此对于各亚型与MTHFRC677T基因多态性的相关性未进行深入研究，有待在以后的临床工作中进一步探讨。