超高效液相色谱-串联质谱法同时测定强力枇杷露中5种罂粟壳生物碱含量

2019-12-30卢森华黎强梁爽陈宇庞小莲唐明华李奎

中国中医药信息杂志 2019年12期

卢森华黎强梁爽陈宇庞小莲唐明华李奎

摘要：目的建立強力枇杷露中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因5种罂粟壳生物碱的多指标成分含量测定方法，为提高其质量标准提供参考。方法采用超高效液相色谱-串联质谱法。色谱条件：色谱柱为Acquity UPLC BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm），柱温40 ℃，流速0.3 mL/min，进样量1.0 μL，流动相为含0.1%甲酸的乙腈溶液-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵水溶液，梯度洗脱;质谱条件：电喷雾离子源（ESI⁺），多反应离子监测（MRM）。结果罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因分别在18.59～185.9 ng/mL（r=0.999 2）、23.26～232.6 ng/mL（r=0.999 1）、11.63～116.3 ng/mL（r=0.999 5）、802.26～8023 ng/mL（r=0.999 5）、149.8～1498 ng/mL（r=0.999 3）范围内线性关系良好，平均回收率分别为103.5%、101.4%、99.6%、98.9%、101.3%，RSD分别为1.9%、2.2%、1.6%、3.4%、1.8%。结论本研究建立的方法操作简便、结果准确、重复性好，可为强力枇杷露质量标准的提升提供参考依据。

关键词：强力枇杷露;超高效液相色谱-串联质谱法;罂粟壳生物碱;含量测定

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2019）12-0062-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.12.014 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous Determination of Five Alkaloids from Opium Poppy Shell in Qiangli Pipa Syrup by UPLC-MS/MS

LU Senhua¹， LI Qiang¹， LIANG Shuang²， CHEN Yu¹， PANG Xiaolian¹， TANG Minghua¹， LI Kui³

1. Yulin Center for Food and Drug Control， Yulin 537000， China; 2. Pharmacy School of Guangxi University of Chinese Medicine， Nanning 530001， China; 3. Pharmacy School of Guilin Medical College， Guilin 541000， China

Abstract： Objective To establish a method for determining multi-indicator contents of papaverine， nacotine， tibain， morphine and codeine in Qiangli Pipa Syrup; To provide referance for improve the quality standard of the preparation. Methods UPLC-MS/MS method was used. The chromatographic conditions were Acquity UPLC BEH HILIC （1.7 μm， 2.1 mm × 100 mm）; the column temperature was 40 ℃; the flow rate was 0.3 mL/min; the injection volume was 1 μL; the mobile phase was acetonitrile containing 0.1% formic acid - 10 mmol/L ammonium phthalate solution containing 0.1% formic acid， with gradient elution. Mass spectrometry conditions： electrospray ionization （ESI⁺） and multi reaction monitoring （MRM）. Results The papaverine， nacotine， tibain， morphine and codeine had good linear relationship in the range of 18.59–185.9 ng/mL （r=0.999 2）， 23.26–232.6 ng/mL （r=0.999 1）， 11.63– 116.3 ng/mL （r=0.999 5）， 802.26–8023 ng/mL （r=0.999 5）， 149.8–1498 ng/mL （r=0.999 3）， respectively. The average recoveries were 103.5%， 101.4%， 99.6%， 98.9% and 101.3%， respectively， and the corresponding RSDs were 1.9%， 2.2%， 1.6%， 3.4% and 1.8%， respectively. Conclusion The method is simple， accurate and reproducible， which can provide references for the improvement of quality standard of Qiangli Pipa Syrup.

Keywords： Qiangli Pipa Syrup; UPLC-MS/MS; alkaloids from Opium Poppy Shell; content determination

基金项目：广西高校中青年教师基础能力提升项目（P18037）;玉林市科学研究与技术开发计划项目（2019年）

通讯作者：陈宇，E-mail：48499917@qq.com

强力枇杷露由枇杷叶、罂粟壳、百部、桔梗、桑白皮和薄荷脑等组成，是《中华人民共和国卫生部标准·中药成方制剂》（第二册）收载品种，具有镇咳祛痰、养阴敛肺功效，用于久咳劳嗽、支气管炎等^[1]。强力枇杷露现行质量标准过于简单，无法有效控制产品质量，市售强力枇杷露产品质量参差不齐^[2]。由于该制剂中含有麻醉药品罂粟壳，若对其用量控制不当，久服易成瘾^[3]。现代化学和药理研究表明，罂粟壳主要有效成分为生物碱类，包括罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因等，属于强成瘾性成分。为确保制剂的安全性及有效性，必须控制其含量。现行药品质量标准中仅有生物碱及黄酮的化学反应鉴别，专属性差，可控性不强，无含量测定项^[1]。目前其含量测定研究仅有HPLC或气相色谱法测定强力枇杷露中罂粟壳中吗啡、可待因或罂粟碱含量的报道^[4-9]。随着现代分析技术的发展，液相色谱质谱联用技术凭借其高灵敏度、专属性强、快速高效等优点，已逐渐成为中药成分定量分析的有效手段^[10]。为此，本试验建立超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）同时测定强力枇杷露中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因5种罂粟壳生物碱含量的方法，以提升强力枇杷露的质量控制水平，从而保证产品的安全性。

1 仪器与试药

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱仪、Waters Xevo TQ-S三重四极杆质谱仪（美国Waters公司），3K15高速冷冻离心机（德国Sigma公司），N-EVAP116型氮吹仪（美国Organomation公司），HYQ-3110型涡旋混匀器（美国精骐公司），XS-205Du型电子分析天平（瑞士 METTLER TOLEDO公司）

盐酸罂粟碱对照品（批号171214-201205，纯度99.9%）、那可丁对照品（批号171224-201304，纯度99.9%）、蒂巴因对照品（批号171216-201304，纯度100%）、吗啡对照品（批号171201-201324，纯度99.1%）、磷酸可待因对照品（批号171203-201306，纯度97.5%），中国食品药品检定研究院;可待因-D₃内标溶液（Cerilliant，批号FE081012-03，1.0 mg/mL）、吗啡-D₃内标溶液（Cerilliant，批号FE102010-04，1.0 mg/mL）;乙腈、甲醇（色谱纯，美国Fisher公司），甲酸铵（优级纯，西亚试剂，批号P22456），甲酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号20170110），QuEChERS AOAC萃取盐包（美国Agilent公司，部件号5982-6755，含6 g无水MgSO₄、1.5 g NaAc），15 mL QuEChERS AOAC分散固相萃取管（美國Agilent公司，部件号5982-5158，含400 mg PSA，400 mg C₁₈EC，1200 mg无水MgSO₄）。10批强力枇杷露样品[华润三九（雅安）药业有限公司4批，批号1803031、1803036、1803045、1804013;云南龙发制药股份有限公司1批，批号180502;广西维威制药有限公司1批，批号181001;江西药都樟树制药有限公司1批，批号160512;哈尔滨康隆药业有限公司1批，批号1612259;广西桂西制药有限公司1批，批号160825;广西恒科药业有限公司1批，批号170302]均为市售。

2 方法与结果

2.1 色谱和质谱条件

色谱条件：色谱柱为ACQUITY UPLC BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）;柱温为40 ℃;流速为0.3 mL/min;进样量为1.0 μL;流动相A为含0.1%甲酸的乙腈、B为含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液，按表1条件梯度洗脱。

质谱条件：离子源为电喷雾离子（ESI）源，正离子模式;毛细管电压3.0 kV;离子源温度120 ℃;脱溶剂气温度300 ℃;RF透镜电压0.5 V;脱溶剂气流速600 L/h;锥孔气流速50 L/h;采集模式为多反应离子监测（MRM）采集，监测离子参数见表2。5种化合物及内标物的提取离子（定量）质谱图见图1。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液及内标溶液制备

精密称取盐酸罂粟碱对照品13.74 mg（相当于罂粟碱12.41 mg），那可丁对照品11.64 mg、蒂巴因对照品15.50 mg、吗啡对照品11.57 mg、磷酸可待因对照品14.52 mg（相当于可待因10.24 mg），分别置20 mL量瓶中，加含0.5%甲酸的甲醇溶液适量，超声溶解并定容至刻度，摇匀，即得对照品贮备液。

精密量取罂粟碱对照品贮备液30 μL、那可丁对照品贮备液40 μL、蒂巴因对照品贮备液15 μL、吗啡对照品贮备液1400 μL、可待因对照品贮备液300 μL，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，即得混合对照品溶液（每1 mL溶液含罂粟碱1.859 μg、那可丁2.326 μg、蒂巴因1.163 μg、吗啡80.26 μg、可待因14.98 μg）。

精密吸取吗啡-D₃、可待因-D₃内标溶液各1.0 mL，置20 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得混合内标溶液（每1 mL溶液含吗啡-D₃、可待因-D₃各50 μg）。

2.2.2 供试品溶液制备

精密量取样品1.0 mL，置50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中，加200 μL混合内标工作液，加5 mL水，振摇均匀，再精密加入15.0 mL乙腈，涡旋1 min，加入QuEChERS AOAC萃取盐包（含6 g无水MgSO₄、1.5 g NaAc），迅速振摇后涡旋1 min，10 000 r/min离心5 min，移取10 mL上清液至15 mL QuEChERS AOAC分散固相萃取管中，盖紧瓶盖并用力涡旋振摇2 min，8000 r/min离心5 min，取上层清液，过0.22 μm有机微孔滤膜，取滤液待测。

2.2.3 阴性对照溶液制备

按处方工艺制备不含罂粟壳的强力枇杷露阴性样品，按“2.2.2”项下方法制备，得阴性对照溶液。

2.2.4 专属性试验

分别精密吸取罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因對照品溶液及供试品溶液、阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱和质谱条件进行测定。在MRM模式下的提取离子流图可见样品中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因各峰分离良好，对照品及供试品溶液目标峰的保留时间一致，且阴性对照无干扰。供试品溶液质谱图见图2。

2.2.5 线性关系考察

分别精密量取混合对照品溶液各0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置10 mL容量瓶，再加入200 μL混合内标溶液，用乙腈定容至刻度，按“2.1”项下色谱和质谱条件进行测定。以吗啡和可待因的色谱峰与相应内标物面积的比值为纵坐标，吗啡和可待因的浓度为横坐标，绘制标准曲线;以罂粟碱、蒂巴因和那可丁的色谱峰面积为纵坐标，罂粟碱、蒂巴因和那可丁的浓度为横坐标，绘制标准曲线。罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因5种生物碱在各自线性范围内呈良好的线性关系，灵敏度较高。吗啡和可待因采用内标法定量，罂粟碱、蒂巴因和那可丁采用外标法定量。5种生物碱线性关系考察结果见表3。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

精密吸取同一混合对照品溶液1.0 μL，连续进样6次，测定峰面积，罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因5种生物碱响应值的RSD分别为1.1%、1.9%、1.2%、1.7%、0.6%。表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取批号为1803031的样品6份，每份1.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，测定浓度并计算罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因5种生物碱的含量。罂粟碱平均含量为2.007 μg/mL，RSD=2.7%;那可丁平均含量为3.558 μg/mL，RSD=2.3%;蒂巴因平均含量为1.383 μg/mL，RSD=1.3%;吗啡平均含量为59.79 μg/mL，RSD=2.1%;可待因平均含量为12.35 μg/mL，RSD=0.2%。表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取上述供试品溶液，分别于0、1、2、4、6、12 h进样1.0 μL，测定其浓度并计算罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因5种生物碱的含量。罂粟碱平均含量为2.121 μg/mL，RSD=1.1%;那可丁平均含量为3.677 μg/mL，RSD=0.7%;蒂巴因平均含量为1.490 μg/mL，RSD=2.3%;吗啡平均含量为60.01 μg/mL，RSD=1.8%;可待因平均含量为12.14 μg/mL，RSD=1.0%。表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.3.4 加样回收率试验

精密量取已知含量（每1 mL含罂粟碱2.007 μg、那可丁3.558 μg、蒂巴因1.383 μg、吗啡59.79 μg、可待因12.35 μg）的强力枇杷露样品6份，每份0.5 mL，精密称定，分别依次精密加入混合对照品溶液（每1 mL溶液中含罂粟碱1.859 μg、那可丁2.326 μg、蒂巴因1.163 μg、吗啡80.26 μg、可待因14.98 μg）400、400、500、500、600、600 μL，按“2.2.2”项下方法制备，分别进样1.0 μL，测定罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因的含量并计算回收率，结果见表4。

2.4 样品含量测定

取10批次强力枇杷露样品，每份1.0 mL，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别进样1.0 μL，测定其响应值并计算罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡和可待因的含量，结果见表5。

3 讨论

参考相关文献^[11-12]，本试验样品处理方法主要考察了传统的溶剂提取法、基质分散固相萃取法（QuEChERS法）、通过型固相萃取法（新型PRiME HLB小柱）进行净化，传统提取方式不能满足快速、高通量检测的要求，用QuEChERS法和PRiME HLB固相萃取小柱进行净化效果基本相同，而QuEChERS法操作更为简单，故选择QuEChERS法为样品处理方法。

在色谱条件和质谱条件的优化中发现，吗啡等生物碱在BEH C18柱上基本不保留，无法分离，因此选择BEH HILIC正相色谱柱，该法重现性好，保留时间稳定，能达到有效分离。此外，本试验还考察了流动相因素（乙腈/含0.1%甲酸的乙腈-0.1%甲酸溶液/含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液不同比例梯度洗脱）、进样量因素（1、5 ?L）对供试品溶液分离效果的影响，最终确定流动相为含0.1%甲酸的乙腈-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液，进样量为1 ?L。

罂粟壳属严格管控的麻醉药品，含罂粟壳药品必须对罂粟壳含量进行有效的控制。罂粟壳中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因5种生物碱为其主要功效成分，其含量过低则无法达到镇咳效果，而含量过高则较易引发成瘾性，故应有效控制其含量，使其在发挥药效的同时减少毒副作用。参照2015年版《中华人民共和国药典》（一部）规定罂粟壳中吗啡含量限度为0.06%～0.40%^[13]。强力枇杷露处方中罂粟壳投料为50 g，制成1000 mL，吗啡含量的限度范围按药材上限100%转移率计算为30.0～200.0 μg/mL。本试验10批强力枇杷露样品的吗啡含量为35.77～85.11 μg/mL，以该指标可判定10批样品均为合格药品。但不同企业样品的其他指标成分含量差异较大，罂粟碱为0.755～4.516 μg/mL、那可丁为0～3.558 μg/mL、蒂巴因为0.558～4.283 μg/mL、可待因为7.867～27.35 μg/mL。因此，提高强力枇杷露的质量标准意义重大，本研究可為强力枇杷露含量限度的确定提供数据参考。

UPLC-MS/MS在不影响分离效果的情况下大大提高了样品中各成分的分析速度，而且提高了该物质的检测限。本研究建立了强力枇杷露中的多指标成分UPLC-MS/MS含量测定方法，在5 min内即可同时准确测定强力枇杷露中罂粟碱、那可丁、蒂巴因、吗啡、可待因5种生物碱的含量，为强力枇杷露的质量控制提供了一种快速、灵敏、稳定、可靠的方法。

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