不同产地两头尖药材的薄层色谱指纹图谱研究

赵丽茹 ，曲 帅 ，李金花 ，吴海英 ，赵利利 ，蔡广知

（1.吉林省生物研究所，长春130012；2.长春中医药大学，长春130017）

两头尖药材为毛茛科植物多被银莲花Anemone raddeana Regel的干燥根茎，性辛，热,有毒。归脾经。具有祛风湿，消痈肿的功效[1]。已经报道的两头尖的药理作用有抗肿瘤、抑菌、镇静等[2]，临床上被广泛应用。两头尖中含有皂苷类、内酯类、挥发油等成分[3]。而已经发表的关于两头尖药材的文献，质量研究方面的报道很少。笔者研究团队在两头尖药材的质量研究方面做了许多工作，包括两头尖的高效液相指纹图谱研究[4]，两头尖中竹节香附素A的含量测定研究[5]，两头尖的红外光谱及紫外光谱研究。本文采用薄层色谱法对不同产地的两头尖药材进行了鉴别研究。

1 试药、试剂与仪器

1.1 试药与试剂

竹节香附素A对照品，中国药品生物制品检定所；甲醇（分析纯）、乙醚、正丁醇，北京化工厂；蒸馏水，自制；硅胶G薄层板（10×10），青岛海洋化工厂。

1.2 仪器

CAMAG LINOMAT 5半自动点样仪、CAMAG TEPROSTAR 3照相仪、CAMAG TLC SCANNER自动扫描仪，均购置瑞士卡玛生化公司。

1.3 中药两头尖药材产地

两头尖药材经长春中医药大学肖寄平教授鉴定均为毛莨科银莲花属多被银莲花 （Anemone raddeana Regel）的干燥根茎，其产地详情见表1。

表1 两头尖药材产地

1.4 混淆品

包括三个混淆品：天葵子、九节菖蒲、香附。

2 实验方法

2.1 薄层色谱条件

薄层板：预制硅胶G薄层板（110℃活化0.5h）

点样量：供试品溶液和对照品溶液各2μL

展开系统：三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）的下层溶液

检测方式：喷以显色剂10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，观察。

扫描条件：双波长扫描，测定波长λR=525nm λS=700nm

2.2 溶液的制备

2.2.1 供试品溶液的制备

称取不同产地的两头尖药材粉末 （过80目筛）约5g，精密称定，置锥形瓶中，加10倍量甲醇，封口，超声提取40min，过滤，滤液回收溶剂至干，残渣加水10ml溶解，用乙醚振摇提取 2次（分别为 20ml、10ml），弃去乙醚液。水液用水饱和正丁醇振摇提取5次 （分别为20ml、20 ml、15 ml、15 ml、15 ml），合并正丁醇液，减压回收溶剂至干。残渣加适量甲醇溶解并转移至10ml量瓶中，再加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得[6]。

2.2.2 对照品溶液的制备

精密称取竹节香附素A对照品适量，制成每1ml甲醇约含0.1mg的溶液，摇匀，即得。

2.3 色谱条件的优选

2.3.1 展开剂的优选

曾用的展开剂有乙酸乙酯-甲醇-水（6∶4∶1），三氯甲烷-甲醇(7∶4)及三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(2.5∶1∶1∶0.1)，三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）。 结果以三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）的下层溶液为展开剂时，斑点清晰，无拖尾现象。而且斑点间分离度好，R f重现性也较好，故选用三氯甲烷-甲醇-水（7∶3∶1）的下层溶液为展开剂[7]。

2.3.2 显色剂的优选

曾选用10%硫酸乙醇试液(105℃加热)、10% 磷钼酸乙醇试液(105℃加热)和香草醛浓硫酸溶液等为显色剂。结果表明，其他显色剂或是斑点较少或是斑点不清晰，而以10%硫酸乙醇试液(105℃加热)作为显色剂，斑点清晰稳定。故而最终选择10%硫酸乙醇试液为显色剂[8]。

2.4 方法学验证

2.4.1 精密度考察

取同一供试品溶液，在同一薄层板上连续点样5次，测定竹节香附素A的Rf值和峰面积，并计算RSD，结果Rf值均值为0.268，RSD值为3.12%(n=6)。峰面积均值为232.78，RSD值为0.12%(n=5)。由精密度相关系数评价结果表明，本仪器的精密度良好。

2.4.2 稳定性考察

取同一供试品溶液， 分别在 0，4，8，12，24h 测定。测定竹节香附素A的Rf值和峰面积，并计算RSD，结果Rf值均值为0.252，RSD值为1.77%(n=6)。峰面积均值为234.88，RSD值为0.15%(n=5)。由稳定性考察结果表明，本方法稳定性良好。

2.4.3 重现性考察

取同一产地供试品5份，按照供试品溶液的制备方法进行处理，测定竹节香附素A的Rf值和峰面积，并计算RSD，结果Rf值均值为0.268，RSD值为1.67%(n=6)。峰面积均值为234.66，RSD值为1.02%(n=6)。由重现性考察结果表明，本方法重现性良好。

2.5 薄层指纹图谱的建立

2.5.1 薄层色谱图的直观分析

依照上述实验方法进行测定[9]，得到两头尖的薄层色谱指纹图谱以及混淆品的薄层色谱图，结果见图1、2、3。

图1 不同产地两头尖薄层色谱图1

图2 不同产地两头尖薄层色谱图2

图3 不同产地两头尖薄层色谱图3

由以上薄层色谱图的可以看出，样品斑点清晰，颜色深浅不同，而3个混淆品的斑点情况跟两头尖样品则存在较大的差异，基本没有达到分离效果。

2.5.2 薄层色谱图的扫描分析

依照上述薄层扫描的参数设置，将获得的薄层色谱图进行薄层扫描，得到两头尖的薄层扫描图以及混淆品的扫描图，结果见图 4、5、6。

图4 薄层扫描图1

图5 薄层扫描图2

图6 薄层扫描图3

将扫描结果进行分析总结，用峰高来代表样品中的出峰情况，0代表未出峰，峰高单位AU，总结见表2-1和表2-2。

表2 -1 18批两头尖薄层扫描结果

表2 -2 18批两头尖薄层扫描结果

从表中可以看出，18个不同正品药材共有5个共有峰，分别是 1，3，4，5，20 号峰。 其中 5 号峰为对照品竹节香附素A，它虽在各个样品中均出峰，但峰高不一，表明竹节香附素A在各个样品中的含量差异较明显。各个产地的两头尖药材除了具有5个共有峰外，其余出峰的个数和峰面积积分值都有所不同。

3 结论

本文采用薄层扫描法对不同产地的两头尖药材进行测定，建立中药两头尖的薄层色谱指纹图谱。对薄层板进行直观分析，可以看出，各个样品出现的斑点明显，而3个混淆品的斑点情况跟两头尖样品则存在较大的差异，说明在此展开系统中，混淆品基本上没有达到分离的效果，通过观察薄层板，可以很快的对样品和混淆品进行鉴别。薄层扫描结果显示所有两头尖样品共出峰20个，根据出峰情况把18个样品大致分为7类，出峰的差异较明显。说明不同产地的两头尖药材存在差异。结果表明，薄层色谱扫描法可以作为两头尖质量控制的一种可靠方法。