鹿茸多肽对单侧颈总动脉结扎所致轻度认知功能障碍模型大鼠的保护作用研究

刘玥欣，徐 岩 ，赵昕彤 ，李 鑫 ，周 佳 ，律广富 ，林 贺 ，许佳明 ，黄晓巍 ，2

（1.长春中医药大学，长春130117；2.吉林省中药生物大分子重点实验室，长春130117）

轻度认知功能障碍 （Mild Cognitive Impairment，MCI）是正常人脑老化发展为阿尔茨海默病（Alzheimer's disease，AD）的过渡状态，提早干预MCI对于降低AD的发病率具有重要意义[1]。中医理论认为：肾藏精，主骨生髓，脑为髓海，年迈体弱，久病及肾，肾精亏虚，髓海失充，脑萎髓空，脑失所养，神机失用而出现呆证，宜采用填精补髓法治疗脑病[2]。鹿茸为“生精补髓”之要药，具有壮肾阳，补精髓等功效，主要有效物质为鹿茸多肽等[3]。脑源性神经营养因子(Brain Derived Neurotrophic Factor，BDNF）是成熟的中枢及周围神经系统的神经元维持生存及正常生理功能的必需因子[4～5]，神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF）含对中枢及周围神经元的发育、分化、生长、再生和功能特性的表达具有重要的调控作用[6～7]。本研究采用单侧颈总动脉结扎法复制轻度认知功能障碍动物模型，通过观察鹿茸多肽对模型大鼠行为学指标、血清、海马组织中BDNF、NGF含量及表达水平的影响，探讨鹿茸多肽对模型大鼠的保护作用机制。

1 实验材料

1.1 动物及饲料

Wistar大鼠60只，体质量220±20g，由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供，许可证号码：SCXK（吉）-2018-0007；鼠维持颗粒料，由长春亿斯实验动物技术有限责任公司提供，批号：20190322。

1.2 药物及试剂

鹿茸多肽，由长春中医药大学中药药理学实验室提供；吡拉西坦，东北制药集团沈阳第一制药有限公司，批号：6171256；BDNF、NGF、GAPDH 及 HRP 二抗，武汉三鹰生物技术有限公司，批号：11527-1-AP、13621-1-AP、10494-1-AP、15134-1-AP； 彩虹 245 广谱蛋白Marker、全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL化学发光法检测试剂盒，北京索莱宝科技有限公司，批号：PR1920、BC3710、PC0020、P1200、SW2010。

1.3 仪器

跳台仪，上海欣曼科教设备有限公司，型号：DTT-2；4℃低温离心机，德国Eppendorf艾本德股份公司，型号：Centrifuge 5810 R；电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技有限公司，型号：DHG-9245A；酶标仪，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司，型号：Multiskan FC；电泳仪，伯乐bio-rad有限公司，型号：BE6085；凝胶成像仪，英国UVItec有限公司，型号：Alliance Q9。

2 实验方法

2.1 动物分组及模型复制[8]

60只大鼠随机分为：假手术组，模型组，阳性对照组，鹿茸多肽高、中、低剂量组，每组10只。单侧颈总动脉结扎法复制MCI动物模型具体方法如下：大鼠腹腔注射水合氯醛（0.35g·kg-1）麻醉后固定，颈前区刮毛、消毒，纵行切开皮肤后分离筋膜、肌肉、左侧颈总动脉，用1号手术丝线永久性结扎左侧颈总动脉，局部给予青霉素预防感染，缝合皮肤，假手术组不进行颈总动脉结扎其余手术同上。给予正常食水，饲养3d。

2.2 给药方法[9～10]

假手术组、模型组给予同体积蒸馏水，阳性对照组给予500mg·kg-1吡拉西坦，鹿茸多肽高、中、低剂量组分别给予 300mg·kg-1、200mg·kg-1、100mg·kg-1鹿茸多肽。各组大鼠均给予正常食水，连续给药18d。

2.3 鹿茸多肽对MCI模型大鼠行为学指标的影响[11]

利用跳台实验检测各组模型大鼠行为学指标，具体方法：将大鼠放于避光箱中适应5min，通电（36V，3min），以受到电刺激作为错误反应评判标准，记录各组大鼠逃避潜伏期、3min内错误次数。

2.4 鹿茸多肽对MCI模型大鼠血清中BDNF、NGF含量的影响

各组大鼠进行腹主动脉取血，4℃低温离心机离心（4000r·min-1，5min），取上层血清，备用。依照 ELISA 试剂盒内说明检测各组大鼠血清中BDNF、NGF含量。

2.6 鹿茸多肽对MCI模型大鼠海马组织中BDNF、NGF表达水平的影响

将各组大鼠处死后，提取海马组织-80℃冰箱保存备用。依照全蛋白提取试剂盒内说明提取各组大鼠海马组织总蛋白，依照BCA蛋白浓度测定试剂盒内说明调节样品蛋白浓度（浓度为2g·L-1），加入2倍体积样品缓冲液后水浴 （100℃，5min），冷却后备用。依照SDS-PAGE凝胶制备试剂盒内说明制备SDS-PAGE凝胶，在加样孔中加入样品 （20μL/孔），电泳（90V，30min；110V，60min），转膜（100V，60min），洗涤 3 次后封闭（摇床60min），洗涤3次后封闭一抗（4℃过夜），洗涤3次后封闭二抗（摇床60min），洗涤3次后加入ECL发光液（孵育1min），取膜放置于凝胶成像仪中，记录实验结果，计算目标蛋白表达水平（目标蛋白表达水平=目的条带灰度值/GAPDH条带灰度值）。

3 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。结果以均数±标准差（x±s）表示，组间样本均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

4 实验结果

4.1 鹿茸多肽对MCI模型大鼠行为学指标的影响

跳台实验结果表明，与假手术组比较，模型组逃避潜伏期明显升高 （P＜0.01）、3min内错误次数明显增多（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组、鹿茸多肽高、中、低剂量组逃避潜伏期明显降低 （P＜0.05或P＜0.01），阳性对照组、鹿茸多肽高、中剂量组3min内错误次数明显减少（P＜0.01）。结果见表1。0.05， P＜0.01。

表 1 跳台实验结果（n=10，x±s）

4.2 鹿茸多肽对MCI模型大鼠血清中BDNF、NGF含量的影响

ELISA实验结果表明，与假手术组比较，模型组BDNF、NGF 含量均明显减少（P＜0.01）；与模型组比较，阳性对照组、鹿茸多肽高、中、低剂量组血清中BDNF含量明显增多（P＜0.01），NGF 含量明显增多（P＜0.05 或P＜0.01）。 结果见表 2。

表 2 血清中 BDNF、NGF 含量比较（n=10，x±s）

4.3 鹿茸多肽对MCI模型大鼠海马组织中BDNF、NGF表达水平的影响

Western Blot实验结果表明，与假手术组比较，模型组 BDNF、NGF表达水平明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，阳性对照组、鹿茸多肽高、中、低剂量组BDNF、NGF表达水平明显升高（P＜0.05）。 结果见表 3、图1。

表 3 海马组织中 BDNF、NGF 表达水平比较（n=10，x±s）

图1 海马组织中BDNF、NGF表达水平

5 结论

鹿茸为名贵中药材，是吉林省道地药材，资源极为丰富，在中医脑病的治疗方面具有悠久的历史。明代李时珍在《本草纲目》中记载“鹿茸，生精补髓，养血益阳，强筋壮骨。治一切虚损，耳聋，目暗眩晕，虚痢”[12]。研究[13]表明，由大脑免疫系统引发的炎症机制驱动了AD的恶化，也就是说MCI的发生与发展可能与机体免疫调节系统息息相关。本研究发现，采用单侧颈总动脉结扎法复制的MCI模型大鼠学习记忆能力明显降低，血清、海马组织中BDNF、NGF含量及表达水平明显降低；而阳性对照组、鹿茸多肽高、中、低剂量组均有所改善，说明鹿茸多肽对单侧颈总动脉结扎法复制的MCI模型大鼠具有保护作用，作用机制可能与调控模型大鼠血清、海马组织中BDNF、NGF含量及表达水平有关。