鹿茸多肽对冠脉结扎心肌缺血模型大鼠心肌特异性转录因子Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C表达的影响

周 佳 ，徐 岩 ，律广富 ，韩 冬 ，赵昕彤 ，王晋冀 ，王亚杰 ，王 宇 ，黄晓巍 ,2

（1.长春中医药大学，长春130117；2.吉林省中药生物大分子重点实验室，长春130117）

近年来，随着生活节奏的提速，生活水平的提高，由于人们饮食结构不合理、生活习惯不规律等因素导致的心脑血管疾病患病几率连年上升[1]。冠状动脉粥样硬化引起的缺血性心脏病严重威胁了人类的身心健康。心脏依赖血液的灌注来维持正常的生理活动，当血液的灌注减少或停止时，会导致心肌组织缺血缺氧、心肌细胞代谢紊乱、心肌功能异常甚至死亡。鹿茸作为我国传统滋补类中药，在保护心肌损伤、促进骨折愈合、提高机体免疫力、延缓衰老、改善记忆力等多方面具有良好的效果[2]。《本草经疏》记载鹿茸入心包，入心经；现代研究表明，鹿茸是哺乳动物中唯一可以完全再生的器官，可用于改善心脏功能；已有研究表明，鹿茸多肽可明显缓解阿霉素所致的大鼠心肌损伤[3]。目前鹿茸多肽对冠脉结扎所致大鼠心肌缺血损伤研究较少。本实验从鹿茸多肽影响心肌特异性转录因子NK型同源盒基因转录因子2.5(NKx2.5)、锌指蛋白转录因子4（GATA4）、激活转录因子 2（ATF-2）、肌细胞特异性增强因子-2C(MEF-2C)表达水平的角度出发，对鹿茸多肽预防和治疗冠脉结扎大鼠心肌缺血的作用机制进行研究。

1 材料

1.1 实验动物

标准Ⅱ导联心电图正常的Wistar大鼠60只，雌雄各半，体质量（270±20）g，长春市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(吉)-2016-0003。常规饲养，适应性喂养3d后用于实验。

1.2 实验药物

鹿茸多肽：长春中医药大学提供；辅酶Q10胶囊：海上药信谊药厂有限公司 （国药准字H19999132）；Nkx 2.5Elisa kit：上海酶联生物科技有限公司（批号：ml2227618）；GATA4、ATF-2、MEF-2CElisa kit：酶免生物科技有限公司 （MM-20697R1、MM-0837R1、MM-0834R1）；苏木素伊红（HE）染色试剂盒：上海碧云天生物科技有限公司，货号：C0105。

2 仪器

大鼠固定器、ML870PowerLab数据采集分析系统、Multiskan FC酶标仪、生物组织自动脱水机、生物组织自动包埋机。

3 实验方法

3.1 动物分组及给药

随机将大鼠分成6组，即假手术组、模型组、阳性对照组、鹿茸多肽高、中、低剂量组，每组10只。假手术组、模型组给予等体积蒸馏水，阳性对照组给予辅酶Q10胶囊3mg·kg-1，鹿茸多肽高、中、低剂量组大鼠分别给予鹿茸多肽 300、200、100mg·kg-1。 实验动物自由饮食饮水，连续给药28d。

3.2 模型复制

参照文献[4]，大鼠称重后，腹腔注射水合氯醛麻醉后结扎心脏左冠状动脉前降支，对比大鼠术前术后心电图，符合典型心梗表现者视为手术成功，存活者列入模型组、给药组。假手术组仅开胸，不结扎冠状动脉[5]。

3.3 检测指标

3.3.1 心电检测[6]

末次给药30min后，乙醚麻醉大鼠，固定于大鼠固定器上，连接八通道生物信号采集处理系统，记录2min内的大鼠心电图和心率，心电图基线设为PR段，比较各组心电图ST段的变化和心率变化。

3.3.2 Elisa法检测各组大鼠血清中 Nkx2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C含量

检测心电30min后，4%水合氯醛麻醉大鼠，打开腹腔，腹主动脉取血[7]，静置 20min，3 500r·min-1离心15 min，取血清，按照试剂盒说明书检测大鼠血清中Nkx2.5、GATA4、ATF-2和 MEF-2C 的含量。

3.3.3 HE染色观察大鼠心肌组织损伤情况

将固定后的心肌组织脱水、石蜡包埋，切成5μm薄片，HE染色，光学显微镜下观察各组大鼠心肌组织形态学变化[8]。

3.4 统计学方法

采用SPSS17.0统计分析软件进行数据处理，计量资料均采用表示，多组均数组间比较采用单因素方差分析，显著性水准P=0.05。

4 实验结果

4.1 各组大鼠心率及心电图ST段变化

与假手术组比较，模型组心率明显上升、ST段明显升高，差异具有统计学意义（P<0.01）。与模型组比较，阳性对照组、鹿茸多肽高、中、低剂量组明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01），结果见表1。

表1 各组大鼠心率及心电图ST段变化（x±s）

4.2 各组大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C含量变化

与假手术组比较，模型组大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C含量显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与模型组比较，阳性对照组、鹿茸多肽高、中、低剂量组大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C含量显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01），其中鹿茸多肽低剂量组与阳性对照组比较，血清中Nkx 2.5和MEF-2C含量显著升高，差异具有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，各组大鼠血清中ATF-2含量无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05），结果见表 2。

表2 各组大鼠血清中Nkx 2.5、GATA4、ATF-2和MEF-2C 含量变化（x±s）（ng/L）

4.3 各组大鼠心肌组织病理学观察

HE染色结果表明，假手术组大鼠心肌组织结构规则，红色部分心肌组织排列整齐，细胞核大小、形态无明显差别，清晰可见，心肌细胞间隙均匀，无炎性细胞浸润。与假手术组比较，模型组组织坏死比例较高，心肌纤维排列紊乱并有溶解断裂，核细胞深染，可见明显炎性细胞浸润，成纤维细胞增生明显。随着鹿茸多肽给药剂量的增加，心肌细胞溶解减轻，心肌纤维排列较为整齐，细胞间隙变小，炎性细胞浸润减少。详见图1。

图1 各组大鼠心脏组织HE染色结果（×200）

5 讨论

据统计[9]，我国14亿人口中约有2.9亿人患有心血管疾病，城乡居民死亡原因中，有40%以上是由于心血管病死亡，高于肿瘤等其他疾病。防治心血管病已经成为中国目前重大的公共卫生问题，对心血管疾病的防治迫在眉睫[10]。

在探讨药物在治疗心肌梗死的疗效及作用机制中，复制相对精准的心肌梗死动物模型至关重要，本研究采用结扎大鼠左冠状动脉前降支的方法复制心肌缺血的发生发展，可以保证梗死部位相对固定，在尽量避免个体差异的同时，提高模型动物的成活率，并最大限度地模拟临床上心肌梗死的病理过程[11]。实验结果表明，对比假手术组和模型组，大鼠心率和心电图ST段的变化符合心肌缺血造模的各项指标，表明实验造模成功[12]。

《神农本草经》中将鹿茸列为中品，中医使用鹿茸防治各类疾病已有两千余年的历史[13]。现代药理学研究表明，鹿茸中含有多种有效成分，其中多肽、蛋白质在鹿茸的药用中占有重要的地位[14]。已有研究证实，鹿茸多肽能够有效减少心肌梗死面积，使缺血区域血管收缩程度减轻，改善血液循环，从而减少心肌梗死后缺血缺氧对心肌细胞的损伤[15～16]。 Nkx2.5，GATA4，ATF-2，MEF-2C是心脏在早期发育过程中表达的转录因子[17]，起到调控心脏结构蛋白基因表达、促进细胞分化方向的作用，在心脏的发育过程中起着重要作用[18]。其中，Nkx2.5在环化、分化、间隔功能成熟、维持传导系统等过程中参与了心脏的形成[19]；GATA4在心肌存活和心脏肥大中起重要作用；ATF-2、MEF-2C可以在自身维持、损伤修复等方面调控心脏特异性调控蛋白。

本研究以鹿茸多肽为研究对象，观察其对冠脉结扎大鼠心肌损伤的修复作用。结果表明，鹿茸多肽可明显保护冠脉结扎大鼠的心肌损伤，恢复心率，调整ST段上调幅度，其作用机制可能与提高Nkx 2.5、GATA4和MEF-2C的水平有关，而ATF-2无明显变化。