温度对提取RNA质量的影响
2019-12-27黄国明李耀东
陈 朗,吴 佳,黄国明,姜 涛,李耀东
(西北民族大学 生命科学与工程学院,甘肃 兰州 730030)
在动物组织中进行RNA提取是分子生物学中的基础实验技术,而提取RNA 的质量将直接影响cDNA文库的构建、基因克隆、基因表达分析和功能基因筛选等后续结果的可靠性[1]。在提取RNA的过程中RNA的质量受到多个因素的影响[2],温度是制约提取RNA质量的重要因素[3]。本实验采用TRIzol法[4]在不同温度(2℃、4℃和8℃)条件下提取鸡肉RNA,探究不同提取温度对RNA质量的影响。
1 材料与方法
鸡来自市场购买,静宁鸡,将鸡进行解剖,将各个组织切割成一定大小后放入研钵中,再加入液氮研磨至粉状,采集研磨好的冷冻组织到离心管,然后迅速加入1 ml Biozol Reagent, 漩涡充分震荡30 s。保证所有的凝块全部溶解。冰上静置5 min,再用2℃(高速冷冻离心机)/4℃(高速冷冻离心机)/8℃(高速冷冻离心机),12 000 rpm离心10 min,除去上层油脂,吸取中间层匀浆液转移至新的离心管中。在离心管中加入1/5体积的氯仿。盖好盖,漩涡剧烈震荡15 s,冰上静置10 min。2℃(高速冷冻离心机)/4℃(高速冷冻离心机)/8℃(高速冷冻离心机),12 000 rpm 离心15 min。溶液分为酚氯仿相、中间相和上层水相。RNA溶解在水相中。转移不超过80%的水相到一个干净的离心管,然后加入等体积的异丙醇,漩涡充分震荡15 s,在冰上静置15 min。2℃(高速冷冻离心机)/4℃(高速冷冻离心机)/8℃(高速冷冻离心机),12 000 rpm 离心10 min,离心后试管底部将出现沉淀。RNA沉淀的清洗:沿管壁轻轻加入1 ml 75%的乙醇,用手轻轻震荡离心管洗涤沉淀。在2℃(高速冷冻离心机)/4℃(高速冷冻离心机)/8℃(高速冷冻离心机),8 000 rpm 离心5 min,弃上清,尽量去除残留乙醇,这样可以减少盐离子污染。RNA沉淀的清洗:沿管壁轻轻加入1 ml 75%的乙醇,用手轻轻震荡离心管洗涤沉淀。7 500 rpm 离心5 min,弃上清,尽量去除残留乙醇,减少盐离子污染。RNA的溶解:室温晾干或真空干燥,然后加入30~50 μl DEPC 水溶解RNA,枪头吸打几次,待沉淀完全溶解。将RNA成品分成几份,放置于-80℃低温冰箱中做长期保存。
取4μl总RNA样品与2μl上样缓冲液(10×loading buffer)混合,以1×TAE为电泳缓冲液,在1%的琼脂糖凝胶上和200V电压条件下电泳30 min,结果用凝胶成像仪拍照保存。
然后对总RNA的质量进行鉴定:使用Shimadzu Corporation公司的UV-1800紫外-可见分光光度计进行260 nm和280 nm紫外光检测,取不同温度提取的总RNA各20μl,加入DEPC水稀释,混匀至1ml,以DEPC水参比,用紫外分光光度计在吸光度为260 mm和280 mm处进行测量,计算OD260 mm和OD280 mm处吸光度的比值,每个样品重复三次,取其平均值,并以经验公式[5]估算RNA浓度=40μg/μl×稀释倍数×OD260 nm。
2 结果与分析
2.1 琼脂糖凝胶电泳结果分析
RNA琼脂糖凝胶电泳的结果是判定RNA质量的重要途径,从28S、18S、5SRNA条带的带型和亮度可以判断出提取RNA的质量。在1%的琼脂糖凝胶上,3种温度所提取的RNA电泳结果如图1所示。3种不同温度提取的RNA电泳移动速率基本一致,2℃条件下所提取的总RNA条带非常暗,4℃条件下提取的总RNA条带拖带严重,无法区分5S位置上的条带,是属于DNA条带,还是5SRNA,亦或是两者的混合物。8℃条件下提取的总RNA条带清晰,无断裂、少降解,拖尾现象的发生。采用3种温度提取出的RNA中,仅有8℃条件下提取出的RNA可用于后续的实验。
图1 RNA样品的琼脂糖凝胶电泳
2.2 不同温度条件下提取RNA含量分析
使用SHIMADZU公司的UV-1800进行260 nm和280 nm紫外光检测,重复三次取平均值,得出RNA浓度检测峰图(图2),并根据结果算出260 nm/280 nm的比值和RNA浓度(表1)。当OD260/OD280的比值在1.8-2.0左右可推断出总RNA未降解,表1中,在4℃条件下②样品的OD260nm/OD280nm远大于2.0,其260nm处的吸光值较小,计算得出总RNA的浓度较低,这可能是由于RNA发生降解或存在DNA和蛋白质的残留。
图2 不同温度提取出的RNA浓度检测峰图
3 讨论
从动物组织中提取出高质量的RNA是对该动物进行研究必不可少的步骤。RNA主要存在于细胞质中,少量存在于细胞核中,细胞中的RNA可分为信使RNA、转运RNA和核糖体RNA三大类,不同组织总RNA提取实质就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白、DNA等杂质,最终获得高纯RNA产物的过程。提取RNA时,使用的Trizol试剂中的主要成分为异硫氰酸胍和苯酚,其中异硫氰酸胍可裂解细胞,促使核蛋白体的解离,使RNA与蛋白质分离,并将RNA释放到溶液中。当加入氯仿时,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA进入水相,离心后可形成水相层和有机层,这样RNA与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离开。水相层(无色)主要为RNA,有机层(黄色)主要为DNA和蛋白质,再通过乙醇析出DNA,异丙醇沉淀蛋白质,即可将RNA分离。
表1 不同温度提取RNA的总RNA的纯度及浓度
本实验结果表明,8℃条件下提取的RNA条带清晰完整,且无拖带现象出现,而4℃条件下提取的RNA有明显拖带现象,2℃条件下提取的RNA已降解。这可能是由于Trizol试剂中的苯酚被氧化后的产物使DNA双链相交联。温度过低,让组织细胞释放的内源核酸酶活性较低,无法将残留的DNA降解,而8℃条件下的内源核酸酶能较好的除去残留DNA,从而得到高品质的RNA。并且紫外分光光度计的结果也验证了这一结论。
综上所述,在8℃条件下提取出的RNA的质量较高。