抗生素混合使用对C57BL/6J小鼠肠道菌群破坏的研究

王悦萦，粟雨芯，李方琳，李凌浩，马忠仁*

(1.西北民族大学 生物医学研究中心 生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030)

抗生素主要是由细菌、霉菌或其他微生物产生的次级代谢产物或人工合成的类似物[1]。一般情况下，合理正常的使用抗生素不会对其宿主产生严重的副作用[2-4]。但滥用抗生素，会导致肠道菌群微环境失调，会对人体健康造成巨大危害。据报道，肠道菌群及其代谢产物的的不良变化与人类的多种疾病相关，包括慢性炎症反应，II型糖尿病，动脉粥样硬化，慢性肾病，以及精神疾病等[5-7]。本研究通过建立肠道菌群失衡的小鼠模型，旨在让人们重视抗生素滥用的危害性，并提醒人们在以后的生活中合理使用抗生素[8-14]。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

本实验所选用实验动物为C57BL/6J小鼠（中国科学院兰州兽医研究所）；所选用的饲料为普通小鼠饲料（南通特洛菲生物有限公司）。抗生素：杆菌肽；庆大霉素；环丙沙星；新霉素；青霉素；甲硝唑；硫酸链霉素；万古霉素；头孢他啶；上述所用试剂均购自阿拉丁生物试剂有限公司。培养基;灭菌无纤维羊血(北京索莱宝科技有限公司)、琼脂培养基。

1.2 实验方法

1.2.1 适应阶段 本实验所用小鼠为六周龄雄性C57BL/6J小鼠（n=14），在12 h光暗循环的无特定病原体动物房（SPF级）中饲养，正常饮食一周后开始试验。

1.2.2 抗生素破坏小鼠肠道菌群 所有小鼠平均分为两组，对照组（n=7）和实验组（n=7）。对照组正常饮食和饮水；实验组小鼠的饮用水为抗生素溶液（具体含量如下: 新霉素100 μg /ml、链霉素50 μg /ml、青霉素100 μg /ml，万古霉素 50 μg /ml、甲硝唑100 μg /ml、杆菌肽1 mg/ml、环丙沙星125 μg /ml、头孢他啶100 μg /ml,庆大霉素170 μg /ml），并每周更换一次抗生素混合溶液，共4周。试验前后，采集小鼠体重及收集小鼠新鲜粪便。

1.2.3 血平板培养实验 为确认小鼠肠道菌群数量变化，故做小鼠粪便血平板培养试验。首先收集小鼠的新鲜粪便于经过高压灭菌的1.5 ml离心管中，然后用无菌生理盐水将粪便配制成10%的粪便混合溶液，吸取上清液涂于5%的羊血琼脂平板上，所有小鼠的粪便血平板均分为有氧和无氧两种培养环境培养。最后将所有血平板放置在37℃的CO2培养箱中培养，12 h后计算每个血平板上面的落数并记录。

1.2.4 小鼠空腹血糖的测量 在实验进行的第0天和第30 d，分别对小鼠进行空腹血糖的测量。所有小鼠在测量前空腹8 h，用血糖仪测量并记录。

2 结果与分析

2.1 肠道菌群失衡后对小鼠粪便中微生物数量的影响

在小鼠的肠道内有多种微生物，微生物菌落的数量变化可以显示抗生素对小鼠肠道菌群的破坏程度。因此，在实验的第0天和30天分别收集实验组和对照组小鼠的粪便样品，对其分别进行有氧培养和无氧培养。结果如图所示，图1、图2表示实验组和对照组在第0天小鼠的粪便样品，分别取0.1 mg进行有氧培养和无氧培养，并对其培养12 h，最后对血平板上的菌落进行计数。结果显示，实验组和对照组的小鼠体内均有菌落，符合实验预期。为了对上述结果进一步验证，本研究还选取了0.05 mg的粪便样品进行血平板培养，结果如图3、图4所示，结果同样显示，实验组和对照组的小鼠体内均有菌落，符合实验预期。

在第30天，收集的粪便样品取0.1mg进行有氧培养和无氧培养，并在培养12 h以后对血平板上的菌落进行计数（如图5、图6）。结果表明，实验组和对照组的菌落数在统计学上有显著差异。作为对照，在实验中称取了0.05 mg的粪便样品进行血平板培养，结果如图7、图8所示，结果同样显示，实验组和对照组的菌落数在统计学上有显著差异。因此，得出结论，在30天的时间里，对实验组小鼠的肠道菌群进行抗生素干扰后，小鼠的肠道菌群明显下降，说明抗生素对小鼠的肠道菌群有破坏作用。图9表示在30天时实验组和对照组的血平板培养图，结果表明实验组血平板培养后肉眼观察不到菌落，而对照组长出很多菌落，以上数据均表明抗生素对小鼠的肠道菌群有很大的破坏作用。

图1 0天有氧培养结果(0.1mg样本)

图2 0天无氧培养结果(0.1mg样本)

图3 0天有氧培养结果(0.05mg样本)

图4 0天无氧培养结果(0.05mg样本)

图5 30天有氧培养结果(0.1mg样本)

图6 30天无氧培养结果(0.1mg样本)

图7 30天有氧培养结果(0.05mg样本)

图8 30天无氧培养结果(0.05mg样本)

图9 30天时血平板培养实验结果

2.2 肠道菌群失衡对小鼠空腹血糖的影响

小鼠在第0天测得的空腹血糖结果如图10所示，通过Graph pad软件对两组小鼠的空腹血糖进行分析，在实验开始前没有统计学差异。在第30天对14只小鼠的空腹血糖再次进行测量，结果如图11所示。通过Graph pad软件对两组小鼠的空腹血糖进行分析，在实验结束时两组结果具有统计学差异，且实验组空腹血糖低于对照组，这种结果可能与肠道菌群的破坏、菌群代谢产物的变化及肠道消化吸收能力的变化有关，但具体原因，还应该经过进一步的实验来证明。

图10 0天空腹血糖结果

图11 30天空腹血糖结果（ *：p＜0.05）

3 讨论

抗生素饲喂小鼠30天后，无论经过有氧还是无氧培养小鼠体内的肠道菌群，实验组小鼠体内的肠道菌群数量均显著减少，这说明不仅是菌群的丰度还是独立种属的数量，都发生了显著的改变，这说明小鼠的肠道菌群被破坏。另外，经过抗生素干预的小鼠的血糖值和对照组也有显著差异，这说明血液等其他指标很有可能由于肠道菌群遭到破坏而发生了变化，这对机体健康会造成危害。肠道微生物群的组成中的不良变化和多种疾病相关，包括慢性炎症反应，类风湿性关节炎，动脉粥样硬化，慢性肾病，以及精神疾病等。抗生素滥用是导致这种现象发生的重要因素。