昆虫细胞无血清培养基的研究

王家敏，马桂兰，冯玉萍，马 伟，马 祺，马忠仁，乔自林*

（1.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030；2.兰州百灵生物技术有限公司，甘肃 兰州 730010；3.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030）

杆状病毒表达系统（Baculovirus Expression Vector System，BEVS）是以杆状病毒为载体，在昆虫细胞上表达外源蛋白的真核表达系统。由于昆虫杆状病毒系统能高水平地生产异源蛋白质，而且能保证异源蛋白质的生物活性并应用于医疗诊断、疫苗生产方面。目前已上市的利用昆虫杆状病毒表达系统生产的疫苗有猪瘟疫苗、猪圆环病毒2型疫苗、宫颈癌疫苗和治疗性前列腺癌疫苗等。另外，2013年美国FDA 批准了Flublok用于19至49岁人群季节性流感的预防，Flublok也成为第一个用昆虫杆状病毒表达系统的流感疫苗[1-3]。

随着昆虫细胞体外培养的需求，昆虫细胞培养基的研发势在必行。本研究以Gibco生产的Grace’s Insect Medium培养基为基础，经改良后用于Sf-21和Hi-five细胞的悬浮培养的无血清培养，该培养基成分明确，支持Sf-21和Hi-five细胞全悬浮生长且状态良好，可为我国昆虫细胞培养技术提供无血清培养基。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 贴壁培养型Sf-21及Hi-five细胞从CCTCC引进，引进后由甘肃省动物细胞技术创新中心经悬浮驯化后保存。

1.1.2 主要试剂及仪器 Grace’s Insect Medium干粉 (Gibco)，葡萄糖（国药集团），水解乳蛋白（HyClone），Pluronic F-68（Gibco），酵母粉（Organotechnie），0.2%台盼蓝（Sigma）、倒置相差显微镜（CK40-32PH型，Olympus），细胞计数仪（CASY TT型，INNOVATIS），电子天平（AR2140型，上海奥豪斯），摇床（2102C型，上海智诚），pH计（MP120-BLE型，梅特勒）等。

1.2 方法

1.2.1 昆虫细胞无血清培养基的制备 浓度50倍的酵母粉浓缩液配制：称取200g酵母粉溶解到500 ml注射用水中，反复搅拌后置2～8℃冰箱，过夜后取出再加500 ml注射用水充分搅拌后用单层普通滤纸过滤后备用。

Grace’s Insect Medium配制：配制4.9 L溶液，其中各种溶质的用量为5 L溶液时溶质的用量（先不加碳酸氢钠）。

将以上两种培养基合并到一起搅拌后，加入30.75 g葡萄糖、13.5 g水解乳蛋白、200 ml浓度50倍的酵母粉浓缩液和20 g PF68，搅拌后再加12.752 g碳酸氢钠后充分混匀，调pH值到6.16，过滤除菌在2～8℃保存备用。

1.2.2 Sf-21、Hi-five细胞无血清悬浮培养 取细胞密度达到2×106/ml以上、对数生长期的Sf-21、Hi-five细胞，按6.0×105/ml的初始密度分别接种上述培养基分别接种，不添加血清，置27℃，100 rpm摇床培养，每24 h取样，显微镜下观察细胞状态，细胞计数仪计数细胞密度，连续培养三代，绘制三个代次细胞平均值的生长曲线。

2 结果

2.1 昆虫细胞无血清培养基的制备

培养基是Grace’s Insect medium培养基基础，添加葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉溶液和PF-68等组份，溶解性好，液体透明，呈微黄色。

2.2 Sf-21、Hi-five细胞无血清悬浮培养

配制的培养基分别无血清培养Sf-21、Hifive细胞，细胞生长均较好，能够很好的全悬浮生长。其中，Sf-21细胞最高密度可达（39.8±2.6）×105/ml，Hi-five细胞最高密度可达（44.4±1.0）×105/ml，细胞计数结果见表1，生长曲线见图2，细胞形态见图1。

图1 昆虫细胞无血清培养基悬浮培养状态（A: Sf-21细胞 B: Hi-five细胞）

图2 无血清培养基培养两种昆虫细胞的生长曲线

表1 两种昆虫细胞无血清悬浮培养三代计数结果

3 讨论与结论

目前成分稳定且广泛应用的商品化基础培养基有Grace′s、IPL-41和TC-100，使用时通常要加10%的牛血清和4g/L酵母浸出液才能正常培养，由于使用时添加动物血清增加了生物安全的风险和下游纯化工艺。无血清培养基主要有Thermo Fisher Scientific公司的Sf-900™SFM、Express Five® SFM 和 HyQ SFX-Insect，LONZA公司的Insect-XPRESS™，Sigma-Aldrich公 司 的 EX-CELL® 405、420和 TiterHigh™Medium等。这些产品均为国外公司生产，由于中国没有相应的产品竞争，外国公司给中国用户的卖价很高，如1L包装的液体EX-CELL®405给中国用户的直销价为650元，导致工业用户生产成本太高产品没有竞争优势[4,5]。Grace’s Insect medium是一种基础培养使用时加血清和酵母浸出液才能维持昆虫细胞生长，价格约为进口商品化无血清培养基的一半左右。

本研究以基础培养基Grace’s Insect medium为基础，添加了葡萄糖、水解乳蛋白、酵母粉溶液和PF-68等组份后可较好的支持Sf-21、Hi-five两种昆虫细胞悬浮生长，为昆虫细胞培养提供了一种价格相对便宜无血清悬浮培养基，为我国利用昆虫细胞杆状病毒表达系统生产生物制品提供培养基的支持。