实验小鼠肾匀浆中肽酶-3样本稳定性分析

2019-12-27冯育芳刘雅丹项新华岳秉飞

实验动物科学 2019年5期

王洪魏杰冯育芳刘雅丹项新华岳秉飞

(中国食品药品检定研究院，北京 100050)

能力验证计划是通过实验室间检测结果的比对来衡量实验室能力的活动，是实验室证明其检测技术能力水平的一种手段。实验动物质量控制是保证实验动物质量和动物实验可靠程度的根本手段[1]。通过开展实验动物领域的能力验证计划，可以增加实验室间的技术交流，了解各实验室在肽酶-3项目的检测技术水平和能力，及时发现并解决检验中存在的问题，促进实验室提高检测水平，从而推动实验动物行业的进步。基于此，中国食品药品检定研究院(国家实验动物质量检测中心)组织实施能力验证项目“NIFDC-PT-106 实验小鼠肾匀浆中肽酶-3的检测”。原有的国家标准GB/T 14927.1—2001中推荐使用了13个用于实验大鼠和小鼠的遗传质量评价的生化标记位点，国家标准修订后，更正为14个生化标记位点。肽酶-3是国家标准GB/T 14927.1—2008修订时，新增的位点。国家标准修订后，广泛开展肽酶-3位点检测的实验室并不多，有必要组织实施该项目的能力验证活动来考察实验室的检测能力。

生化标记法中14个生化标记位点均为蛋白质成分，肽酶-3也不例外。肽酶-3对温度敏感，对保存时限也有要求。作为能力验证项目，有必要对肽酶-3样本的稳定性进行考察。

能力验证样品的稳定性考察是能力验证工作顺利开展必不可少的环节，同时也是能力验证计划实施成败与否的关键因素，更是关乎能力验证活动结论可信度的重要条件。基于此，本研究针对影响肽酶-3稳定性的两个主要因素：温度和时间，进行稳定性考察，以期获得肽酶-3样本的保存条件和运输条件，在项目实施过程中加以利用。

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物：20只SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠和15只SPF级8周龄雌性BABL/c小鼠，均来源于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2012-0001]。20只SPF级8周龄雌性CBA小鼠，来源于北京华阜康生物科技股份有限公司[SCXK(京)2014-0004]。按实验动物使用的3R原则给予人道的关怀。

1.2 样品制备

本次能力验证项目提供的被测样品为小鼠肾匀浆的冻干样品。制备方法：采用颈椎脱臼法处死动物，剖腹，取小鼠肾脏，加入预冷的蒸馏水，蒸馏水与肾脏的比例为2∶1(V/W)。用组织匀浆器匀浆，然后置4 ℃低温高速离心机中，15 000 r/min，30 min。取上清，加保护剂，分装，每瓶装量70 mg/瓶，用冻干机冻干。小鼠肾匀浆冻干样品为红色固体。加盖，封口膜封口，封口袋包装。采用随机数字方式编号。贮藏条件为密封，2～8 ℃冷藏[2-4]。

1.3 稳定性检验

1.3.1分别将时间和温度设为横、纵坐标，设定-20 ℃，4℃，室温和37℃4个温度检验点，设定1、2、3、4、5、6、7、14 d和28 d为9个时间检验点，在每个坐标交点，每个型别的样品分别随机抽取1瓶进行检验。

1.3.2在取出日期，依据GB/T 14927.1—2008对样品进行检测，观测稳定性结果。所有样品均需加入70 μL蒸馏水还原。

1.3.3记录各型别不稳定结果出现的时间和温度，当不稳定点出现后，其之后的时间温度观测点随之取消，37 ℃的样本稳定性同时检测1～6天的结果。但即使一直稳定，本测定的观测周期也仅为28 d时长。

1.3.4汇总稳定性结果，填写各自时间温度稳定性结果报告单。稳定用“○”表示，不稳定用“×”表示。

1.3.5稳定性结果判定：每观测点每型别均抽取1瓶，电泳染色。如发现任何1瓶发生条带模糊不可读，则认为在该点样品的稳定性已经发生了变化，即在该时间温度条件下该型别样品不稳定。

注：A代表CBA样本，B代表BALB/c样本，C代表C57BL/6样本
Note:A shows CBA samples,B shows BALB/c samples,C shows C57BL/6 samples

2 结果

肽酶-3样本选用了3个品系的小鼠进行制备。共制备85份CBA样本，82份BALB/c样本，82份C57BL/6样本。样本总数为249份。

肽酶-3样本在37 ℃观测至第6天，该样本仅能稳定保存1 d，在保存至第2天时，条带模糊，无法辨认。2～6 d均为模糊条带。在4 ℃、室温和-20 ℃可以稳定保存至28 d。详见表2。

表2 肽酶-3样本的稳定性检验结果Table 2 Results of stability detection for PEP3 samples

如图1所示，在室温条件下，3个品系的3类样本放置1 d和2d的电泳条带，清晰可见。如图2所示，在4 ℃条件下，3个品系的3类样本放置3 d和4 d的电泳条带，清晰可见。如图3所示，在-20 ℃条件下，3个品系的3类样本放置5 d和6d的电泳条带，清晰可见。如图4所示，在-20 ℃条件下，3个品系的3类样本放置14 d和28 d的电泳条带，清晰可见。

图1 在室温条件下放置1 d和2d的肽酶-3样本电泳图注：1：A37；2：A93；3：B40;4:B12；5:标准1(b)；6：标准2(a)；7:C46；8:C68Fig.1 Electrophoresis map of 1 day and 2 days at room temperatureNote:1：A37；2：A93；3：B40;4:B12;5:Marker1(b)；6：Marker2(a);7:C46;8:C68

图2 在4 ℃条件下放置3 d和4 d的肽酶-3样本电泳图注：1:A20；2:A99；3:B70；4：B89；5:标准1(b)；6:标准2(a)；7:标准3(a)；8:C72；9:C54Fig.2 Electrophoresis map of 3 dasy and 4 days at 4 ℃Note:1:A20；2:A99；3:B70；4：B89；5:Marker 1(b)；6:Marker 2(a)；7:Marker 3(a)；8:C72；9:C54

图3 在-20 ℃条件下放置5～6 d的肽酶-3样本电泳图注：1:A27；2:A13；3:B93；4：B83；5:标准1(b)；6:标准2(a)；7:标准3(a)；8:C43；9:C74Fig.3 Electrophoresis map of 5 days and 6 days at -20 ℃Note:1:A27；2:A13；3:B93；4：B83；5:Marker 1(b)；6:Marker 2(a)；7:Marker 3(a)；8:C43；9:C74

图4 C样本在室温，4 ℃，-20 ℃条件下放置14 d和28 d的肽酶-3样本电泳图注：1:C86；2:C92；3:C69；4：C60；5:标准1(b)；6:标准2(a)；7:标准3(a)；8:C39；9:C14Fig.4 Electrophoresis map of C sample in 14 days and 28 days at room temperature,4 ℃ and -20 ℃Note:1:C86；2:C92；3:C69；4：C60；5:Marker 1(b)；6:Marker 2(a)；7:Marker 3(a)；8:C39；9:C14

3 讨论

3.1 贮存温度

温度升高将导致蛋白质的生物学活性丧失，酶的生物学功能失效。生化标记方法是通过生物化学方法染色来识别不同品系动物在各生化标记位点的差异。一旦酶的生物学功能丧失，将无法通过酶的不同蛋白表型将不同品系的动物区分开来。肽酶-3能力验证活动中，各实验室将获得3份不同蛋白表型的样本。因此肽酶-3样本的稳定性尤为重要。在温度的选择上，考虑到能力验证样品在运输，存储和检验过程中可能出现的极端条件，本研究选择了4个温度点：37 ℃，室温，4 ℃和-20 ℃。选择室温，而不是设定为25 ℃，是希望温度条件尽量接近真实情况。北京1～2月的室温在20 ℃左右，肽酶-3样品可稳定保存至28 d。考虑到南北方的气候差异，北方的室温10 ℃，南方可能是40 ℃。所以，室温的存放时间应因地域而异。在4 ℃和-20 ℃，肽酶-3样本可以稳定保存至28 d。因此，在样本制备完成到发放样品之前，样本应保存在-20 ℃条件下；样本的运输应保存在4 ℃以下的容器中；如果条件允许，最好也存放于-20 ℃条件下；接收样本的实验室，应在第一时间将样本转移至低温冰箱。温度是导致肽酶-3样本不稳定的首要因素，因此，样本的贮存和运输必须严格控制温度。

3.2 贮存时间

依据能力验证项目的实施周期，包括运输和检验的时间，可在28 d内全部完成。所以没有进行更长期的稳定性检验。肽酶-3样本在37 ℃条件下仅能稳定保存1 d，在其他3个温度检验点可以稳定保存至28 d。因此，样本应新鲜制备，如果长期存放，应进行长期稳定性考察[5-6]。接收样本的实验室应在接收样品后尽快进行实验。如果不能及时进行实验，应在第一时间将样本转移至低温冰箱保存。因为参加实验室遍布全国各地区，对于路途较远，交通不便的地区，样本应区别对待，应采取更多的控温措施，例如：保证足够数量的干冰。样本保存的时间越长，稳定性出现偏差的风险越大。尤其应缩短样本在室温的保存时间。